肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体和gDNA标准物质的研制 （二）

1.3方法

1.3.1DNA提取

采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组，具体方法和步骤参照试剂盒说明书。所提取的菌株DNA利用核酸蛋白分析仪和Qubit荧光定量测定仪检测基因组DNA的纯度和浓度，并送北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组测序。

1.3.2细菌全基因组测序及生物信息学分析

经电泳检测合格的DNA样品用超声波破碎仪随机打断成长度约为350bp的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成文库制备。使用Qubit2.0和Agilent2100对构建好的文库进行初步定量和插入片段检测。插入片段符合预期后，使用Q-PCR对文库的有效浓度进行准确定量。文库检测合格后采用北京诺禾致源科技股份有限公司的IlluminaNovaSeq6000测序系统进行全基因组测序。对illumina测序平台的数据进行低质量过滤，包括去除无效信号、去除测序接头和锚定引物序列、去除复杂序列和重复序列，从而获得高质量的有效数据（CleanData）进行后续分析。使用SOAPdenovo软件进行组装，用RAST对组装序列进行注释(http://rast.nmpdr.org)。使用基因组流行病学中心（CenterforGenomicEpidemiology）CGE的默认阈值，对组装序列进行鉴定（http://www.genomicepidemiology.org），利用ThePathosystemsResourceIntegrationCenter（PATRIC）对基因组组成进行分析（https://www.patricbrc.org/），利用CGEVirulenceFinder在线数据库对血清分型、MLST分型和毒力基因进行分析。

1.3.3特征性基因PCR检测方法

将提取的CMCC44841基因组DNA定量后，分别进行10倍梯度稀释，得到10-1、10-2、10-3、10-4系列浓度，参照GB4789.6-2016中引物序列和PCR检测方法，进行astA、aggR、pic特征性基因PCR扩增和灵敏度检测，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.3.4标准物质的生产制备

1.3.4.1EAEC菌体标准物质的制备

取CMCC44841一代新鲜培养物，划线接种于TSA平板，36℃培养24h。用无菌棉签从平板上刮取菌落，加入到含有海藻糖和胎牛血清的冻干保护剂中，涡旋混匀，用移液枪吸取20μL在低温下速冻成球，然后于冷冻干燥机中冷冻干燥。将冻干后的菌球置于2mL的西林瓶中，利用冷冻干燥机进行真空压盖密封。最终制备成EAEC含量为103CFU/样品的菌球。

1.3.4.2EAECgDNA标准物质的制备

将纯度A260/A280为1.7的20µgDNA加入到20ml含有葡聚糖的冻干保护剂中，用移液枪吸取20μL在低温下速冻成球，然后于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，最终制备成含量为20ng/样品的菌球。将冻干后的菌球放入2mL的西林瓶中，将胶塞虚掩的盖在西林瓶上，然后用冷冻干燥机进行真空压盖。

1.3.5标准物质均匀性测试

1.3.5.1EAEC菌体标准物质均匀性测试

根据标准物质均匀性研究抽取样品数量要求，从制备的一批600瓶标准物质中随机抽取20瓶样品，每瓶样品充分溶于1mL生理盐水，使用螺旋涂布仪E50模式在TSA平板上进行螺旋涂布，每个样品2个平行。36℃培养24h后对平板进行菌落计数。根据CNAS-GL003对计数结果进行单因子方差分析，评价样品的均匀性。

1.3.5.2EAECgDNA标准物质均匀性测试

根据标准物质均匀性研究抽取样品数量要求，从制备的一批300瓶标准物质中随机抽取10件样品，向每瓶标准物质样品加入100μLddH2O，充分溶解，制备成20ng/100μL浓度的DNA样品，取2μL作为模板，参照GB4789.6-2016中引物序列和PCR检测方法，进行astA、aggR、pic特征性基因PCR扩增。

1.3.6标准物质稳定性测试

1.3.6.1运输稳定性

将制备的EAEC菌体标准物质和gDNA标准物质分别存放于25℃和37℃条件下，EAEC菌体标准物质模拟实验周期为7天，分别于1、3、5、7天抽取3个样品，进行含菌量测定。根据CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ准则对结果进行稳定性评价。EAECgDNA标准物质模拟实验周期为14天，分别于1、3、5、7、14天抽取3个样品，对特征性基因进行PCR扩增，考察样品的运输稳定性。

1.3.6.2储藏稳定性

将制备的EAEC菌体标准物质及gDNA标准物质分别于-20℃、4℃条件下保存2个月。于4℃保存7、14和28天，-20℃保存28和60天，分别抽取3个样品进行菌含量测定，于4℃和-20℃保存28、45和60天分别抽取3个样品进行特征性基因检测，考察样品的储藏稳定性。根据CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ准则对EAEC标准物质进行稳定性评价。

1.3.7标准物质的协作验证

使用上述制备好的样品，按照国家药品标准物质协作标定实施细则，发给3家实验室，代码分别为A、B和C，每家实验室收到10件样品，参照协作验证作业指导书对样品中EAEC标准物质及其gDNA标准物质进行检验，包括菌落计数和特征性基因检测。

1.3.8标准物质使用效果验证

根据GB29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》，选择熟肉制品、乳粉、腐乳、饼干和薯片5种食品基质共20份样品对EAEC标准物质的使用效果进行验证，样品信息见表1。先将EAEC103CFU浓度的标准物质溶于1mL生理盐水中，每件样品各称取2份，25g/份，一份正常检验，一份加入标准物质100μL，根据GB4789.6-2016进行操作。增菌后划线分离平板观察是否有典型菌落生长，并进行PCR确认。

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