柚皮苷二氢查尔酮的抗氧化活性研究（一）

1963年，俞福惠等发现二氢查尔酮及其衍生物可作为甜味剂，并从柑橘黄烷酮中提取了柚皮苷二氢查尔酮（NariNgiNDC）等。二氢查尔酮的甜味持续时间长，口感清爽，甜度高，热量低，安全无毒，能有效的屏蔽苦味。二氢查尔酮类化合物对糖尿病有一定作用。此外，二氢查尔酮类化合物具有药效基团-2，6-二羟基苯乙酮结构，该基团有抗氧化作用，通过消除过氧化物、清除羟自由基来实现。欧阳振宇以柚皮渣为原料，超声波辅助提取柚皮苷，并用D101大孔树脂分离富集，得到纯度为83.7%的柚皮苷；对柚皮苷在碱性条件下加压并以钯碳作为催化剂合成柚皮苷二氢查尔酮（NariNgiNDC），产率为85.2%。文献和以超声波辅助乙醇提取香柚皮中的柚皮苷，并用弱极性AB-8树脂分离纯化柚皮苷，NaOH作为洗脱剂，得到纯度为77.26%的柚皮苷碱溶液，最后将该碱液在催化剂雷尼镍的作用下，加氢合成NariNgiNDC。李晚谊等研究表明云南甜茶有强的过敏作用，其抗过敏作用的有效成分是二氢查尔酮-4’-β-D葡萄糖苷和二氢查尔酮-2’-β-D葡萄糖苷。方旭兵等研究表明龙血树醇提取物龙血竭的主要成分——龙血素A和龙血素B均为二氢查尔酮类化合物，经对相关二氢查尔酮合成和修饰以及用HepG2细胞进行抗肝癌肿瘤活性筛选，发现二氢查尔酮类化合物中F-18和F-16抗肝癌肿瘤活性较好。杨美琪研究表明利用硅胶、大孔树脂、MCi-CHP20P及葡聚糖凝胶柱等分离方法，结合薄层色谱及HPLC分析木枣枣根醇提物，得到含量较高的二氢查尔酮-4’-β-D-吡喃葡萄糖苷等16个化合物。目前，NariNgiNDC的活性研究报道较少，本研究对其抗氧化活性和美白活性进行初步探讨。

1材料与方法

1.1材料、试剂与设备

柚皮苷标准品，上海源叶；NariNgiNDC标准品，上海源叶；新橙皮苷二氢查尔酮标准品，上海源叶；ABTs，碧云天生物；酪氨酸酶，上海源叶；其它试剂均为分析纯；AuToｄoCkviNa1.1.2，美国sCripps研究所。EL204-iC分析天平，美国METTLERTOLEDO公司；5ML移液枪，美国EppeNｄorF公司；syNergyTX多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；MuLTiskaNGo全波长读数仪，美国TherMosCieNTiFiC公司。

1.2试验方法

1.2.1ABTs自由基清除能力测定

通过3.0Mg/ML柚皮苷、1.0Mg/MLNariNgiNDC、0.30Mg/MLNHDC、0.0025Mg/ML槲皮素与ABTs自由基反应，测定其吸光值，绘制TroLox（0.15，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50MMoL/L）标准曲线，计算其与TroLox的相同清除能力时的用量。具体操作步骤：

1）在96孔板的每个检测孔中加入200μLABTs工作液。

2）空白对照孔中加入10μL蒸馏水或PBs等适当溶液，标准曲线检测孔内加入10μL各种浓度的TroLox标准溶液，样品检测孔内加入10μL样品，轻轻混匀。

3）室温孵育2～6MiN，于波长734NM处测定吸光度。

4）根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力，用TroLox等效抗氧化能力（TroLoxEquivaLeNTANTioxiｄaNCapaCiLy，TEAC）来表示。

1.2.2羟自由基清除能力测定

通过3.0Mg/ML柚皮苷、1.0Mg/MLNariNgiNDC、0.50Mg/MLNHDC、0.15Mg/ML槲皮素与羟自由基反应，测定其吸光值，绘制TroLox（0.01，0.025，0.05，0.10，0.15Mg/L）标准曲线，计算其与TroLox的当量，进而比较抗氧化能力强、弱。

按照表1所列顺序向酶标板中加入对应试剂，按表1规定的条件操作，以TroLox为标准品绘制标准曲线。

样品的抗氧化能力根据式（1）进行计算。抗氧化能力值以TroLox相同抗氧化能力时的用量（μMoLTroLox物质的量/g）表示，即1g样品相当于TroLox的μMoL数。

式中，A_样品—样品吸光度；A_空白—样品空白吸光度；A_TroLox—TroLox溶液吸光度；M_TroLox—TroLox溶液的物质的量（μMoL）；M_样品—样品的质量（Mg）。

FerriC-TPTZ工作液[300MMoL/L醋酸盐缓冲液（0.31g三水合醋酸钠+1.6ML冰醋酸+超纯水至100ML，pH3.6]、10MMoL/LTPTZ的40MMoL/盐酸溶液和20MMoL/LFeCL₃·6H₂O溶液，以体积比10∶1∶1混合），室温反应30MiN后，于波长593NM处用酶标仪测定其吸光度。吸光值的大小与样品的抗氧化能力成正比。维生素C的标准曲线配制浓度为：25，50，100，200，400，800μMoL/L，测定结果以维生素C为参考标准，结果表示为μMoLAAE/g干重。平行测定3次，结果取平均值计算。

1.2.4 ORAC法测定样品的氧自由基清除能力

通过3.00g/L柚皮苷、1.00g/LNariNgiNDC、3.00g/LNHDC、0.0125Mg/ML槲皮素与过氧自由基反应，测定其吸光值，绘制TroLox（62.5，125，250，500，500，1000MoL/L）标准曲线，计算其与TroLox的物质的量，比较抗氧化能力强、弱。

该方法以偶氮类化合物AAPH作为过氧自由基来源，荧光素钠盐为荧光指示剂。将荧光素钠盐、AAPH和水溶性维生素C类似物TroLox分别用磷酸盐缓冲液（pH7.0）溶解，在96孔板中依次加入25μL各浓度的TroLox标准品溶液和样品以及200μL荧光光素钠盐溶液（8.68NMoL/L），然后，将孔板放入荧光酶标仪中，用GeNe5软件编程操作，37℃预热30MiN，迅速加入AAPH溶液25μL（153MMoL/L），自动振荡摇匀，在激发波长485NM，发射波长528NM处用荧光酶标仪测定。初始吸光强度值记为f₀，以后每隔1MiN测定一个点，共测定120MiN，荧光强度分别记为f₀，f₁，f₂…f₁₂₀，根据公式（2）统计各浓度的曲线下面积AUC值。ORAC的含量越高，抗氧化能力越强。

TroLox标准曲线配制浓度分别为62.5，125，250，500，1000μMoL/L，测定结果以TroLox为参考标准，结果表示为μMoLTroLox（TE）/g干重。平行测定3次，结果取平均值计算。

1.2.5 NariNgiNDC与人铜锌超氧化物歧化酶sOD的分子对接

采用CheMBioDrawULTra14.0画出化合物槲皮素和NariNgiNDC的结构，然后用CheMBio3DULTra14.0转化为三维结构，并用sybyL软件的MMFF94力场进行优化。人铜锌超氧化物歧化酶sOD的三维结构（PDBiD：3RE0）从RCsB蛋白数据库下载。铜锌超氧化物歧化酶和化合物均使用AuToｄoCkTooLs1.5.6转化为PDBQT格式。采用AuToｄoCkviNa1.1.2进行分子对接。铜锌超氧化物歧化酶活性位点的坐标设置为：size_x=15，size_y=15，size_z=15；CeNTer_x=1.346，CeNTer_y=-3.077，CeNTer_z=30.419。为了增加计算的准确度，将参数exhausTiveNess设置为20。除了特别说明，其它参数均采用默认值。最后，选取打分值最高的构象用PyMoL1.7.6进行结果分析。1.2.6酪氨酸酶活性抑制试验通过熊果苷（0.625，1.25，2.5，5，10Mg/ML）、柚皮苷（0.625，1.25，2.5，5，10Mg/ML）、NariNgiNDC（0.625，1.25，2.5，5，10Mg/ML）、NHDC（0.625，1.25，2.5，5，10Mg/ML）与酪氨酸酶反应测定其吸光值并绘制曲线，求出iC50值，进而比较抗氧化能力强、弱。

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