单核细胞增生李斯特菌质粒DNA参考物质的研制（二）

1.2.5 pDNA的定值与不确定度分析

pDNA Listeria的特性值由8个不同的实验室用UV方法协同测定，检测结果通过统计检查以确认每组数据没有异常值和显著差异后，将8个实验室的结果平均值作为该pDNA标准品的特性值。进而参考ISO指南35,根据公式(3)计算质粒DNA在定值过程引入的不确定度(uq):

其中：s为总平均值的标准偏差，p为实验室数目。

pDNA的不确定度由三部分组成，分别是：由于分装过程中不均匀性引入的不确定度(uh)、长期保存引入的不确定度(us)、定值过程引入的不确定度(uq)。按照公式(4)计算参考物质的标准不确定度：

计算扩展不确定度时，应将标准不确定度乘以包含因子(k,k=2)。所以，扩展相对不确定度计按公式(5)计算：

1.2.6 qPCR试验

分别对pDNA和从Listeria:H7标准菌株中提取的gDNA通过A260进行定量。根据单增李斯特菌基因组大小2.90 Mbp估算gDNA的拷贝数，并基于4 271 bp估算pDNA Listeria的拷贝数。公式(6)用于计算每微升质粒DNA和基因组DNA(gDNA)的拷贝数。

定量完成后，分别使用2×106～2×101拷贝/L的pDNA Listeria和gDNA制备10倍稀释系列浓度样品用于进行qPCR检测。qPCR分析使用ABI SYBR FAST qPCR Master Mix(2×),在八联管中以25μL体积进行PCR反应(引物序列和扩增子大小见表1),每个反应均含10 pmol/L引物。PCR程序：95℃预变性10 min,95℃变性30 s,55℃退火45 s进行40个循环。根据qPCR结果生成pDNA和gDNA的五点标准曲线。

1.3统计学分析

使用SPSS 16.0和Graphpad 5.0软件进行统计分析。均匀性测试使用单向方差分析。稳定性分析使用单向线性回归分析来计算斜率β1,当|β1|

2结果

2.1质粒构建和pDNA Listeria纯度鉴定

合成了含有hlyA、plcB、inlA基因的DNA片段，并将该片段插入克隆载体pUC57中，制备了重组质粒pDNA Listeria(见图1)。pDNA经提取纯化后，经测序证实，重组质粒中插入片段的序列准确度为100%,符合预期(见图2)。同时pDNA的A260/A280比值为1.863±0.234,介于1.8～2.0之间，A260/A230的比值超过2.0,表明该pDNA溶液中无乙醇、蛋白质或RNA污染。

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