牡蛎中产广谱细菌素芽孢杆菌的筛选及鉴定（三）

2.5 细菌素粗提

硫酸铵提取得到的细菌素粗提物对蜡样芽孢杆菌有明显的抑菌效果。用PBS和0.2mol/LNaCl溶液洗脱经硫酸铵得到的细菌素粗提物并分别收集其洗脱液然后冻干。经抑菌试验发现经过PBS和0.2mol/LNaCl洗脱的组分可以较好地抑制蜡样芽孢杆菌（图3）。

2.6 三羟甲基甘氨酸-SDS-PAGE电泳结果

图4是产细菌素芽孢杆菌的Ｔricine-SDSPAGE电泳结果。由于Ｔricine-SDS-PAGE电泳可以较好地分离＜30ku的蛋白，因此选用3.3～20.1ku的标准蛋白做对照。与Marker条带对比可知菌株O在14.4ku左右时有一条较为明显的条带。菌株19在8ku和18ku处有明显的蛋白条带。菌株F则在8ku处、14.4ku左右均出现明显的条带。菌株4-1在14.4ku左右时有一条蛋白条带。4株芽孢杆菌的Ｔricine-SDS-PAGE电泳结果可以初步判断出其所产细菌素的分子质量均小于20ku。该结果也表明这些菌株所产细菌素可能为热稳定性较好的II类小分子蛋白。

2.7 LC-MS/MS鉴定结果

表4为产细菌素芽孢杆菌的LC-MS/MS鉴定结果。结合Ｔricine-SDS-PAGE电泳试验结果可以初步判断菌株O所产细菌素可能为13ku大小的含有DUF1093结构域的蛋白质、13.506ku大小的YlbF家族监管蛋白及18.877ku的1型谷氨酰胺转移酶；菌株19产生的细菌素可能为8.969ku的假设蛋白CXF51_07005、16.871ku大小的SPBc2原噬菌体衍生的蛋白质YolA以及18.001ku大小的假设蛋白BESＴ7613_2224；菌株F所产细菌素可能为分子质量大小为8.089ku的假设蛋白C1Ｔ28_21195、13.011ku大小的降解酶（加氧酶）、15.786ku大小的holin家族蛋白质以及分子质量为17.082ku的SMI1/KNR4家族蛋白；菌株4-1产生的细菌素可能对应为9.439ku的小分子质量的酸溶性孢子蛋白Ｔlp或是分子质量为22.529ku的3-己酮糖-6-磷酸合成酶。目前的结果与蛋白数据库内已编号的蛋白比较，没有完全一致的蛋白相匹配，表明本研究中发现的细菌素不排除为新型细菌素的可能。细菌素进一步纯化，氨基酸序列比对和产细菌素的细菌全基因组序列进行测序分析，从而准确判断这4株芽孢杆菌所产细菌素是否为新型细菌素。

3 结论

本研究从福建牡蛎中分离筛选出14株对常见致病菌有抑菌活性的芽孢杆菌菌株，通过抑菌试验发现这些芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、植物乳杆菌等革兰氏阳性菌及弗氏柠檬酸杆菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、志贺氏菌等革兰氏阴性菌均有一定的抑菌作用。同时，这些芽孢杆菌产的细菌素具有热稳定性强、易被蛋白酶分解和由核糖体编码合成产生细菌素等典型细菌素特征。根据14株菌的抑菌谱范围和rep-PCR结果，初步判断4种菌株可能不同于其它芽孢杆菌。因此，选取这4株菌O（解淀粉芽孢杆菌），4-1（死亡谷芽孢杆菌），19和F（枯草芽孢杆菌）进行下一步试验。通过Ｔricine-SDSPAGE电泳试验，这4株芽孢杆菌产的细菌素分子质量均不大于20ku。说明上述4株细菌可能产II类乳酸菌细菌素。利用LC-MS/MS鉴定并比对现有蛋白质数据库，结果显示这4株芽孢杆菌所产细菌素未在现有数据库中发现，细菌素进一步纯化，氨基酸序列比对和产细菌素的细菌全基因组序列进行测序分析仍需在未来试验中进行，从而准确确定这4株芽孢杆菌的细菌素性质。

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