果胶对多酚氧化酶活性及热稳定性的影响（一）

发布时间：2021-09-11 21:43 编辑者：特邀作者周世红

多酚氧化酶(Polyphenoloxidase，PPO)广泛分布于植物细胞内，因果蔬内部组织的暴露而激活，可催化单酚羟基转化为邻二酚或将邻酚氧化成醌，而醌类物质极易受到蛋白质或氨基酸的亲核攻击生成黑色素，导致果蔬褐变。发生褐变的果蔬感官品质急剧下降，营养成分被破坏，难以被消费者接受。近年来的研究发现，高压、热、脉冲电场及化学抑制剂等处理手段在模型体系中对PP0活性展现出较好的抑制效果。然而，与模型体系相比，相同处理手段在食品体系中的钝酶效果具有较大差异，PP0在食品体系中对热和高压钝化的抵抗性普遍强于模型体系。本课题组先前的研究发现梨(cv.Packham)PPO在模型体系(50mm01/L，pH6.0，Mcllvaine缓冲液)中经70℃加热10min后相对活性为16.7％；在梨泥食品体系中经90℃加热10min后，其活性仍高达37.8％同。此外，Dalmadi等发现草莓PP0在模型体系(100mm01/L，pH5.0，PBS)经500～700MPa高压处理15min后活性急剧下降，而Terefe等报道PPO在草莓泥食品体系中经相同条件处理后活性无显著变化。与食品体系相比，模型体系成分相对单一，食品体系中复杂的食品组分可能是这种差异形成的重要原因。

果蔬富含多种营养物质，其中果胶是一类由半乳糖醛酸及其衍生物组成的酸性杂多糖。广泛分布于植物细胞的初生壁和中胶层中，构成果蔬坚硬的质地。果蔬在鲜切、榨汁和制作果蔬泥等加工过程中，由于机械损伤作用果胶可与PPO发生自然接触，同时果胶作为食品添加剂也被广泛应用于果蔬制品。另一方面，在果蔬贮藏及澄清果蔬汁的制作过程中果胶又常被降解或除去，因此果胶是果蔬加工过程中的一个可控制因素。近年来针对食品中生物大分子问相互作用的研究逐渐兴起，其中以蛋白质与多糖二元复合物为典型代表。有研究报道果胶可通过静电相互作用、范德华力以及氢键等非共价作用力与蛋白质结合，从而使蛋白质性质发生改变。因此，果胶作为一种果蔬加工过程中常被添加或去除的物质，它与PPO之问的相互作用很可能影响果蔬制品中PPO活性、稳定性及酶促褐变的发生。研究果胶对PPO活性及稳定性的影响，不仅有助于控制果蔬制品酶促褐变，也为探讨食品组分影响酶促褐变的机理提供理论参考。

本文以蘑菇PPO为主要研究对象，使用紫外分光光度计、荧光分光光度计等考察果胶对PPO酶促反应活性、热钝化动力学、热失活构象变化以及抗坏血酸、柠檬酸、阿魏酸和水杨酸等有机酸抑制PPO活性的影响，以期从食品组分角度解释PP0在模型体系和食品体系中出现稳定性差异的原因，为果蔬实际生产应用及褐变控制方法的选择提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

双孢蘑菇PP0(T3824-250ku，2687U/kg)、橘皮果胶(半乳糖醛酸≥74.0％)，美国Sigma-A1drich公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸，上海西陇科学股份有限公司：水杨酸，天津市永大化学试剂有限公司；抗坏血酸、阿魏酸、左旋多巴(L-DOPA)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1600PC型紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；超纯水系统，法国Millipore公司：HH-4型数显恒温水浴锅，江苏省荣华有限公司；F-4500型荧光分光光度计，日本日立仪器有限公司；pH计，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果胶-PP0溶液的制备

参考果胶在饮料及鲜果中所占的比重，以50mmol/LpH6.8的磷酸缓冲液为溶剂配制不同质量浓度的果胶溶液和0.35mg/mL的PP0溶液以确保PP0活性在合适范围内，将果胶与PP0等体积混合使果胶质量浓度最终分别为0，O.5，1，2，3，4，5，10和20mg/mL，PP0终质量浓度为0.175mg/mL并置于25℃恒温孵育30min。

1.3.2 PPO活性的测定

PP0活性的测定参照Liu等的方法,将0.1mL混合酶液加入到2.9mL2mm01/LL-DOPA溶液中开启反应，使用紫外-可见分光光度计于25℃监测其在波长475nm处1min内吸光度的变化值，通过斜率可计算PP0氧化L-DOPA的活性,以未添加果胶的PP0样品为空白对照。

1.3.3 热稳定性与热钝化动力学分析

参照Terefe等和周磊等的方法，分别将PP0与不同质量浓度果胶的混合溶液置于45～60℃水浴锅中处理不同时间。以样品中心温度达到既定温度时开始计时,加热结束后立即置于冰水浴中迅速冷却。其钝化过程可用式(1)描述，通过线性回归拟合可得到其钝化动力学曲线。

式中，A₀-初始酶活，U；At-时间的相对酶活性，U；k-钝化速率，min^-1；t-时间，min。

1.3.4 荧光光谱分析

参考Liu等的方法略作修改。使用F-4500型荧光分光光度计于25℃测定样品的内源荧光光谱，发射与激发狭缝宽均5nm，激发波长280nm，扫描波长范围300～420nm，扫描速度1200nm/min,所有光谱均通过不含PP0的样品光谱作为空白进行修正。

1.3.5 抑制剂对PP0的抑制作用

选用抗坏血酸、柠檬酸、阿魏酸和水杨酸4种常见的有机酸，用浓度分别为0.6，1.2，1.8，2.4mm01/L的抗坏血酸溶液，浓度分别为5，10，15，20mmol/L的柠檬酸溶液，浓度分别为5，7.5，10，12.5mm01/L的阿魏酸溶液和浓度分别为1，4，7，1lmmol/L的水杨酸溶液处理含5mg/mL果胶的PP0溶液，30min后测定其相对活性。