不同减菌剂对鲜切芫荽的减菌效果（一）

芫荽为叶菜类，其表面微生物数量多，种类复杂。微生物的侵染不仅会影响芫荽的外观，实质上也降低了食用价值，减少货架期时间”。芫荽种植的土壤、气候等环境条件不同，随着种植技术的提高与范围的扩大，鲜切加工规模的不断扩大，从田间到餐桌的环节增多，这些都增加了鲜切芫荽微生物污染的风险，也增加了微生物控制的难度。

次氯酸钠、氯气、次氯酸钙等能在水中产生次氯酸的杀菌剂总称为含氯杀菌剂，其中次氯酸钠是目前应用最广泛的含氯杀菌剂。此杀菌剂以氯为主，在水溶液中形成有强氧化性的次氯酸，次氯酸可穿透微生物的细胞膜进人细胞，与胞内蛋白质产生氯化反应从而凝固细胞液，可有效杀死细菌，效果明显且反应速度快。目前，很多企业主要使用次氯酸钠作为杀菌剂，并主要监测菌落总数与大肠菌群的控制情况。由于次氯酸钠可能存在氯残留而对人体健康产生危害嘲，因此需要扩充绿色安全的杀菌剂种类，不断挖掘新的杀菌剂并严格控制其使用浓度。

过氧乙酸是一种酸性强氧化剂，易溶于水、乙醇、乙醚、硫酸等溶剂，有强烈的刺激性酸味，对人的眼睛、皮肤、黏膜和上呼吸道有刺激作用，性质不稳定，遇热或有机物、金属离子、强碱等易分解。

过氧乙酸可杀灭细菌繁殖体、真菌、病毒、分枝杆菌、细菌芽孢等微生物，且在低温下仍有效，其杀菌效果受浓度、温度、相对湿度、有机物等因素影响网。过氧乙酸在质量浓度为50mg/1下就能达到良好的杀菌效果，几乎对所有鲜切果蔬表面的腐败菌和致病菌有明显抑制效果，但因其穿透力不强，低浓度下虽对悬浮的微生物效果明显，而对紧紧吸附在鲜切产品表面的微生物作用不明显嘲。过氧乙酸反应的副产物是水和氧气，对人体和环境无毒无害，因此被认为是一种绿色环保的杀菌剂，FDA已将其定为非冲洗食品接触表面消毒杀菌剂。过氧乙酸作为氯系杀菌剂的替代品，在鲜切果蔬加工中得到广泛研究与应用。

与含氯制剂相比，二氧化氯不会与有机物反应生成致癌、致突变、致畸的物质，是目前国际上公认。的最新一代高效、广谱、安全的杀菌保鲜剂同。它能迅速氧化病毒蛋白质衣壳中的酪氨酸，抑制病毒的特异性吸附，阻止其对宿主细胞的侵染，还能与细菌及其他微生物蛋白质中的部分氨基酸发生氧化还原反应，分解破坏氨基酸，抑制微生物蛋白质合成，从而导致微生物死亡。许多欧美国家有关组织已批准和推荐二氧化氯用于食品的消毒、防腐、保鲜等，世界卫生组织(WH0)已将二氧化氯列为A1级安全高效消毒剂，我国卫计委也已批准二氧化氯为消毒剂和新型食品添加剂。

上述3种减菌剂在鲜切芫荽中的减菌效果还缺乏研究，因此作者采用次氯酸钠、二氧化氯和过氧乙酸处理鲜切芫荽，确定适合于鲜切芜荽的最佳减菌剂，通过16SrDNA全基因组测序技术鉴定鲜切芫荽表面细菌种类，分析主要致病与致腐细菌，以期更有效地提高鲜切芫荽产品的安全性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

芫荽：市售。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂

次氯酸钠、二氧化氯、过氧乙酸、氯化钠、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、琼脂、乳糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、月桂酸硫酸钠、煌绿乳糖胆盐肉汤培养基、氢氧化钠、盐酸、乙醇、牛肉膏、蛋白胨、结晶紫、草酸铵、碘片、碘化钾、番红、松柏油、SK1201-UN10-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒等。

1.2.2 主要仪器

DJ300精密电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；YXQ-SG41-280手提式压力蒸汽灭菌锅：上海华线医用核子仪器有限公司产品：SW-CJ-1FD洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品；GRP-9160型隔水式恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司产品；XW-80A微型旋涡混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司产品：HH-6数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司产品：SPX-320型智能生化培养箱：宁波江南仪器厂产品；PCR反应扩增仪：加拿大BBI公司产品：3730测序分析仪：美罔ABI公司产品；H6-1微型电泳槽：上海精益有机玻璃制品仪器厂产品；凝胶成像系统：GeneGenius公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品及减菌剂的准备

挑选无黄叶、无机械伤、无病虫害、新鲜度基本一致的本地鲜切芫荽，去根，清水洗至可直接食用，晾干至无水渍，待用。

次氯酸钠(5.2mg/1)配制成质量浓度为0、50、100、150、200、250mg/1的溶液，测定pH分别为6.32、10.33、11.37、11.70、11.90、12.07。

二氧化氯(8mg/1)配制成质量浓度为0、20、40、60、80、100mg/1的溶液，测定pH分别为5.90、3.16、2.87、2.73、2.56、2.41。

过氧乙酸(15.7mg/1)，由A液(冰醋酸和硫酸)和B液(过氧化氢)以体积比10:8制得1000mg/1溶液，反应24h后稀释成0、50、100、150、200、250mg/1，测定PH分别为6.93、4.79、4.03、3.78、3.60、3.52。
1.3.23种减菌剂处理

比较3种减菌剂减菌效果，选择效果最佳的减菌剂，以优化减菌剂处理参数。3种减菌剂处理条件见表1。所有处理在室温下进行，每个处理重复3次。

1.3.3 二氧化氯正交处理

按照1₉(3⁴)正交表，对处理浓度(20、40、60mg/1)、处理时间(2、5、10min)、水菜体积质量比(4m1:1g、8m1:1g、12m1:1g)三因素进行正交试验，对照组为清水洗前及清水洗后待用的样品。正交试验表见表2。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 菌落总数

参照GB/T4789.2-2016。

1.4.2 大肠菌群

参照GB/T4789.3-2016。

1.5 细菌的分离纯化与保藏

无菌环境下，称取25g鲜切芫荽置盛有225m1无菌生理盐水的锥形瓶中，置于摇床80r/min，摇动20min，立即将样品液稀释至1×10^-3、1×10^-1、1×10^-5二三个梯度，吸取1m1样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做2个重复同时，分别吸取1m1无菌生理盐水加入2个无菌平皿内作空白对照。及时将牛肉膏蛋白胨培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。于(36±1)℃倒置恒温培养(48±2)h。试验重复3次、观察细菌的生长情况及菌落的颜色和特征，并选取优势菌挑取单菌落，采用平板划线法于牛肉膏蛋白胨培养基划线纯化。于(36±1)℃倒置恒温培养(48±2)h。连续纯化5代。

挑取纯化第5代的单菌落接种于牛肉膏蛋白胨斜面，于(36±1)℃倒置恒温培养(24±2)h。置于4℃冰箱中保藏。

1.6 细菌形态观察

1.6.1 简落形态观祭

观察纯化第5代平皿内菌落大小、菌落形态、菌落颜色、菌落表面特征(光滑与否、干燥与否、是否凸起、是否透明、是否存在同心环等)、边缘规则与否。

1.6.2 革兰氏染色

参照CB/T4789.28-2013。

1.7 16SrDNA序列的分析及其系统发育树的建立

1.7.1 DNA提取

参照上海生工SK1201-UNIQ-10柱式细菌基凶组DNA抽提试剂盒说明书操作。

1.7.2 PCR扩增细菌的16SrDNA序列

1) 引物序列

正向引物27F：5’-AGACTTTCATCCTGGCTCAG-37；反向引物1492R(1510)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

2) PCR反应体系建立(50μ1)

模板DNA10pmo1，上游引物1μ1，下游引物1μ1，dNTPMix1μ1，10×TaqreactionBuffer5μ1，高保真聚合酶(5U/μ1)0.25μ1，无菌超纯水补足至50μ1。

3) PCR程序设定

98℃预变性5min：95℃变性35s，55℃退火35s，72℃延伸90s，35个循环；延伸8min。

1.8 种属鉴定

将PCR产物送到测序公司进行测序。将测序完成的16SrDNA序列在GenBank(NCBI)中进行B1AST检索，寻找相似序列并下载，用MEGA软件制作系统发育树确定细菌种属。

1.9 数据处理

数据取3次重复平均值，采用Exce1、SPSS18.0、正交设计助手等软件对数据进行分析。

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