细胞壁缺失对副溶血性弧菌生物学特性的影响（一）

发布时间：2021-10-17 08:56 编辑者：特邀作者周世红

副溶血性弧菌是一种嗜盐性弧菌，属于革兰氏阴性短杆菌，该菌大多存在于近海岸的贝类和海水鱼类等水产品中，有时也会出现在腌渍食品中，是世界上沿海地区引起食物中毒主要的食源性致病菌之一。据估计，每年约有7600万人患病，5000人死于食源性疾病。其中很大一部分归因于沙门氏菌和副溶血性弧菌。副溶血性弧菌最早是在1950年日本的一次由沙丁鱼引起的大规模食物中毒事件中发现的，之后逐渐在各国的沿海地区发现，并持续至今，已超过沙门氏菌成为世界食源性致病菌之首。其感染途径主要是食用未完全煮熟的海鲜类食品，进而导致急性胃肠炎，甚至会使人死亡。同时，副溶血性弧菌也是水生动物弧菌病爆发的病原体，给水产养殖业带来巨大的经济损失。深入研究副溶血性弧菌的防控技术，对促进水产品的食用安全和海洋经济发展具有双重意义。

由于在临床治疗和水产养殖系统中广泛使用抗菌剂，副溶血性弧菌中耐药株的流行日益加剧，50％的临床和环境分离株具有耐多药性。自1968年喹诺酮类药物问世以来，临床上一直未引入有效对抗革兰氏阴性菌的新型抗生素同。细菌对现有抗生素已进化出多种对抗机制，如通过主动外排系统增强药物的外排作用，产生口一内酰胺酶使药物失去活性，或将药物作用的靶点加以修饰或改变等等，急需寻找具有新的作用位点且安全有效的替代防治策略。

革兰氏阴性菌之所以很难找到有效的抑制药物，主要是因为其细胞的包膜结构较复杂。具有双层膜结构(位于内侧的细胞质膜称为内膜，细胞壁最外层的膜称为外膜)。在两层膜间为肽聚糖层。与外膜共同构成细胞壁。外膜是革兰氏阴性菌的特有构造，具有典型的不对称性磷脂双层结构，由脂多糖、磷脂和外膜蛋白构成。一直以来，细胞与外界环境的物质交换部位主要关注的是细胞质膜，近10年间研究人员才开始关注外膜，尤其是外膜蛋白在物质穿膜过程中的作用。外膜蛋白包括连接外膜层与肽聚糖层的脂蛋白和跨外膜的孔蛋白。单体孔蛋白由8～22个偶数跨膜链以反向平行方式通过相邻链间的氢键作用形成β-桶状结构。跨膜链的数量决定孔蛋白的拓扑结构，从而导致孔径的不同。孔蛋白可以选择性地吸收各种营养物质，同时也能阻拦多种有害大分子物质进入细胞。在去掉细胞壁的大肠杆菌原生质体中，胞内高积累化合物与胞内低积累化合物之间的积累差异明显变小，这一结果证实外膜是小分子在革兰氏阴性菌中化合物积累的主要障碍啊。吴贤斌等曾将大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW去除，发现缺失株对硫酸新霉素和氨苄青霉素的敏感性明显增加。与亲本株相比，在大肠杆菌孔蛋白OmpF/OmpC缺失株中观察到高积累药物积累量显著降低。说明小分子穿过外膜主要通过孔蛋白同。以上研究结果均显示，细胞壁尤其是外膜对于革兰氏阴性菌的生存是必不可少的，而去除细胞壁或是外膜对于革兰氏阴性菌可能是致命的。

肉桂醇是我国《食品添加剂使用卫生标准》中允许使用的食品香料。被证实对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑菌效果

Mazzarrino等针对肠炎沙门氏菌和单增李斯特菌筛选出21种有抑菌活性的精油，发现肉桂的抑菌效果是有效的。目前关于肉桂醇对副溶血性弧菌的抑制作用及机理的研究尚未见报道，本文采用肉桂醇作为抑菌剂探究细胞壁的缺失对副溶血性弧菌生物学特性的影响。明确肉桂醇的作用靶点，为副溶血性弧菌的防控提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基和试剂

副溶血性弧菌保存于-80℃超低温冰箱中。

3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)、营养琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司。以上培养基均121℃灭菌20min。
肉桂醇、Tris、EDTA、硫酸粘杆菌素、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、SYBRGreenI、PI，生工生物工程(上海)股份有限公司；溶菌酶、马来酸盐，合肥博美生物科技有限责任公司：考马斯亮蓝G-250。天津市福晨化学试剂厂；蔗糖、氯化镁、磷酸二氢钾、乙醇，天津市天力化学试剂有限公司；磷酸、氢氧化钠、无水碳酸钠、氯化钠、碳酸氢钠，天津市风船化学试剂科技有限公司：常用药敏试纸，杭州滨和微生物试剂有限公司；牛血清蛋白，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器、设备

ZD-85A气浴恒温振荡器，金坛市科析仪器有限公司；真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；G154DS型自动蒸汽压力灭菌锅，厦门致徽仪器有限公司；5804R高速冷冻离心机，Eppendorf中国有限公司；Czone5F自动菌落计数仪，杭州迅数科技有限公司；perkinelmerv3酶标仪，成都必成丰瑞生物技术有限公司：UV-2550紫外-可见分光光度计。日本岛津公司：Scientz-IID超声波细胞粉碎机。宁波新芝生物科技股份有限公司；SDS电泳系统、GelDocXR+凝胶成像仪，美国BIO-RAD有限公司；AccuriC6Plus流式细胞仪，BD生物科学北京卓越中心。

1.3 试验方法

1.3.1 菌体活化及原生质体制备

将副溶血性弧菌按1％的接种量加入APW中。37℃、130r/min培养12h，连续培养2代。

参考Xu等的方法制备副溶血性弧菌原生质体。将活化的菌液置于4℃、6000r/min离心收集菌体细胞。用0.01mol/LTris-Hcl(pH7.0)洗涤3次。细胞重悬于含有0.5mol/L蔗糖的0.01mol/LTris-Hcl(pH7.0)中，缓慢加入EDTA溶液(pH8.0。20min之内完成此步)至其终浓度为0.01mol，L。37℃、100r/min振荡20min，获得一组除去外膜层的细菌细胞，留此阶段部分菌体冷藏备用。另一部分菌体在4℃、3000r/min离心收集细胞，用SMM缓冲剂(20mmol/L马来酸盐、0.5mol/L蔗糖、20mmol/LMgCl2，pH6.5)清洗2次，细胞重悬于SMM缓冲剂(含1mg，mL溶菌酶)中，37℃、100r/min振荡30min，除去肽聚糖层，缓慢滴加EDTA溶液(pH8.0)使其终浓度为0.01mol/L，放入37℃的培养箱温育15min。获得一组去壁的细菌细胞，将此原生质体冷藏备用。未处理的菌体同样冷藏备用。

1.3.2 最小抑菌浓度测定

采用二倍稀释法处理肉桂醇原液(质量浓度为1g/mL)，使其质量浓度依次为原液的1/2至1/2048。试管内物质组成为8.9mLAPW、1mL菌液(分别为UG、OMDG和CWDG)和0.1mL不同质量浓度的肉桂醇溶液。所有试管置于37℃培养24h后观察菌体生长情况，使培养液保持澄清的最小药物质量浓度即为肉桂醇对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度(MIC)。

1.3.3 细胞膜完整性测定

参考张赞彬等的方法，将菌悬液在4℃、3000r/min条件下离心15min收集菌体，磷酸缓冲液(pH7.0)清洗并重悬。向新的离心管中加入10mL菌悬液和45仙L肉桂醇(1/4MIC、1/2MIC、MIC、空白)，37℃培养6h，在6000r/min下离心3min收集上清液。在波长260nm处测定其吸光度值，即为菌液中核酸的含量。同时采用考马斯亮蓝法对上清液中的蛋白质进行染色，测定其在波长280nm处的吸光度值，即为菌液中蛋白质的含量。

1.3.4 硫酸粘杆菌素试验

考Richter等的方法并适当修改，先向96孔板每孔中加入20μL硫酸粘杆菌素溶液(6μmol/L)和178μL稀释好的菌悬液，静置30min，再加入不同质量浓度的肉桂醇(1/4MIC、1/2MIC、MIC、空白)2μL，混匀并置于37℃培养18～24h后用酶标仪测定其在波长280nm处的吸光度值。

1.3.5 外膜蛋白的提取及质量浓度测定

参考Chiu等的方法进行外膜蛋白的提取，并稍作修改。在4000r/min、4℃条件下收集细胞，经4℃生理盐水洗涤3次。重悬于少量体积的盐水中。利用超声波细胞粉碎机进行细胞破碎处理(300W、冰浴5min)，间歇10次完成。在5000r/min、4℃条件下离心20min，收集上清：于15000r/min离心40min，沉淀重悬于2g/100mLSLS中并在室温条件下孵育1h后，于15000r/min离心40min，沉淀即为外膜蛋白。

利用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定获得的外膜蛋白质量浓度。首先利用标准蛋白溶液绘制标准曲线，如图1所示。测定波长595nm处外膜蛋白样品的吸光度值。根据标准曲线公式计算出外膜蛋白的质量浓度。

1.3.6 外膜蛋白SDS-PAGE

采用非连续缓冲系统垂直板电泳，选用12％分离胶，5％浓缩胶。外膜蛋白样品沸水浴5min，加样量为20μL[16μL蛋白溶液+4μL(5×)蛋白上样缓冲液]，80V电压进行样品浓缩，样品进入分离胶后加压至120V，当溴酚蓝即将跑出胶板时，停止电泳。胶板考马斯亮蓝染色后置于凝胶成像系统拍照。

1.3.7 外膜蛋白竞争试验

考Lam等的方法进行外膜蛋白竞争试验，并作一定的改动。将50μL肉桂醇、50μL外膜蛋白(质量浓度在2～512μg/mL)加入96孔板中，37℃下孵育1h。之后向每孔中加入100μL副溶血性弧菌悬液(约2.5×106个/mL。使肉桂醇终质量浓度为1/2MIC)，37℃下孵育2h。各孔中取出50μL混合培养液，转移至第2个96孔板中，并加入100μL盐水和染料混合物(即含有0.1％SYBRGreenI和0.1％PI的盐水)，用流式细胞仪分析第2个96孔板中的各孔，确定细胞凋亡情况。