好氧堆肥用枯草芽孢杆菌GX2产芽孢工艺优化（一）

好氧堆肥化是有机固体废弃物减量化、无害化及资源化的有效途径之一，是在微生物作用下通过高温发酵使有机物变成腐熟肥料的过程。好氧堆肥不仅含有大量可被植物吸收利用的有效态氮、磷、钾及其化合物，而且含有构成土壤肥力的重要活性物质腐殖质，既解决了有机同体废弃物的环境污染问题，又起到改良土壤和增加肥效的作用。在好氧堆肥过程中添加外源微生物菌剂可有效提高堆体中功能微生物的数量，加快有机物转化及堆肥进程，提高肥效。Xi等通过接种复合菌剂增加堆肥过程中细菌的多样性，可有效提高堆肥效率。Zhao等发现在堆肥过程中接种放线菌可显著提高纤维素酶活性，加速纤维素降解，提高腐殖质含量，减少温室气体排放。微生物菌剂的应用效果与活菌数密切相关，有效活菌数是衡量微生物菌剂品质的重要指标，然而，随着微生物菌剂保存时间的延长，活菌数不断减少，降低菌剂的使用效果，同时，微生物菌剂的制备成本较高，影响了其工业化应用。

芽孢杆菌具有较强的抗逆性，能耐热、酸和碱等不良环境，可有效保持菌剂中的微生物活性，提高菌剂质量及应用效果王雪莲等采用响应面法对影响枯草芽孢杆菌B579的培养基进行了优化，为进一步提高细胞浓度和后续放大培养提供参考，同时，对其产芽孢条件进行了优化。王法国等通过单因素试验、Plackett-Burman试验设计和响应面法对解淀粉芽孢杆菌JT84的培养基成分和发酵条件进行了优化，所得发酵液的芽孢含量为1.67×109CFU/mL，与基础培养基相比，提高了159％。郭晓军等通过对堆肥用产蛋白酶菌株的单因素、正交试验产芽孢条件优化，芽孢产率达95.0％，为解决以芽孢杆菌为主的微生物菌剂产业化生产过程中存在的活性低等问题提供了重要参考。

作者采集污泥与秸秆混合好氧堆肥样品，进行微生物初筛、复筛及分离纯化，分子鉴定后获得一株用于好氧堆肥的枯草芽孢杆菌GX2，具有耐高温、耐酸等特点，将其应用于堆肥过程能有效缩短堆肥周期，提高堆肥品质。针对上述枯草芽孢杆菌GX2，通过摇瓶培养条件优化，在3L发酵罐中通过分批补料技术进一步提高细胞浓度，并通过单因素和正交试验优化产芽孢工艺条件，可为降低其发酵及菌剂制备成本提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

堆肥用菌株：好氧堆肥用枯草芽孢杆菌GX2为实验室保存菌株；种子培养基：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，pH为7.2±0.2；计数培养基：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH为7.0～7.2；摇瓶及3L发酵罐的基础培养基：酪蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，pH7.3，消泡剂0.2％(体积分数)；补料培养基：50g/L的蔗糖溶液；营养肉汤、营养琼脂、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硫酸锰、蔗糖和硝酸钠：上海国药集团产品。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株活化及种子液制备

将4℃冰箱内保藏的菌株接入已灭菌的液体肉汤培养基中，摇床上45℃、160r/min活化12h后，在同体营养琼脂培养基上三区平板划线，置于45℃培养箱中培养24h，挑选三区单菌落传代两次后，作为发酵菌株使用。

挑取已活化的发酵菌株单菌落，接种于装有100mL已灭菌的肉汤培养基250mL三角瓶中，置于摇床振荡培养，在温度为45℃，转速为160r/min培养12h作为种子液。

1.2.2 摇瓶培养基及培养条件优化

在摇床发酵培养基的基础上，以0D值为指标，对菌株GX2进行碳源种类(葡萄糖、蔗糖、淀粉)、最佳碳源质量浓度(5、10、20、30、40g/L)、氮源种类(酵母粉、氯化铵、硝酸钠)、最佳氮源质量浓度(5、10、15、20、25g/L)、装液量(50、100、150、200mL)的单因素优化。摇床培养的初始条件为温度45℃，转速160r/min,装液量100mL(250mL)，pH7.3。实验在同一时问取样测定0D值来优化培养基及其培养条件,优化后的培养基用于发酵罐培养。每组试验3次重复，结果取平均值。

1.2.3 发酵罐分批补料培养

发酵罐型号为B10TECH-3JG-3JG-9000D，上海保光公司产品。在前期摇床培养基和培养条件优化的基础上，将发酵罐初始条件设置为工作体积1.5L、压力0.05MPa、搅拌转速300r/min、温度45℃、接种量为1×107CFU/mL，通过流加3mol/L的Na0H和HCl将DH值自动控制在7.3。将3L发酵罐进行灭菌，然后装入1.5L发酵培养基于121℃灭菌30min，取出后将温度、pH、转速、溶氧设置在初始条件，以1×10⁷CFU/mL的接入量接种新鲜活化的GX2种子液。

分批发酵是在上述条件下上罐进行菌株发酵，测定发酵过程中0D值、残糖浓度、活菌数，获得菌株在发酵罐上的补料时间和补料量。分批补料发酵是在分批发酵的基础上，当总糖量消耗一半时,加入碳源至原浓度，继续发酵培养，当细胞浓度达到稳定时停止补料发酵。以最大0D值和最大活细胞数作为参考值，来分析分批发酵和分批补料发酵的效果。

在分批补料发酵的基础上，取样测定活菌数和芽孢数，绘制芽孢曲线图。在产芽孢时开始控制条件来优化芽孢率，并在芽孢率最大时取样测定。

1.2.4 发酵罐培养条件优化

1)单因素优化芽孢率在发酵罐分批补料优化的基础上，分别研究培养温度、搅拌转速和pH值对芽孢杆菌产芽孢的影响。

2)正交试验优化芽孢率根据单因素实验结果得到的pH(4)，温度(B)、转速(C)的基础上，设计3因素3水平正交试验，并根据正交试验数据的极差分析，得到菌株产芽孢的最佳发酵条件。

3)追加验证实验根据正交试验分析的最佳发酵培养条件，进行追加验证实验。

1.3 分析测试项目与方法

细胞浓度：采用比色法，以空白培养基作参比.在600nm处测定发酵液0D值。活细胞数：采用稀释平板培养计数法，发酵液进行10倍稀释后，涂布平板进行活菌计数。

芽孢数：将发酵液在70℃下处理15min后。冷却，采用稀释梯度平皿计数法统计活菌数。

芽孢率：芽孢数占活菌数的百分数。

总糖含量：采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法。

2 结果与分析

2.1 摇瓶培养条件优化

2.1.1 生长曲线绘制

微生物菌株生长一般经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期4个阶段。首先是菌体生长的迟滞期，生长缓慢，细胞浓度基本不会增加；适应新环境后，微生物生长繁殖速度加快，细胞浓度快速提高，进入对数生长期：此后，随着底物不断被消耗，细胞浓度进入稳定期：底物进一步消耗殆尽，微生物生长进入衰产期，细胞浓度明显下降。绘制微生物菌株的生长曲线可为其培养条件优化提供重要参考，图1给出了枯草芽孢杆菌GX2的发酵液0D值随培养时问的变化情况。

由图1可知，细胞浓度在前期有短暂的生长停滞期，之后发酵液在波长600nm处的吸光度呈直线上升趋势，至14h时，细胞浓度达到最大，A_600nm为1.698，之后开始下降。通常情况下，处于对数生长期的菌株活力最强，细胞浓度也最高，因此，确定14h为枯草芽孢杆菌GX2的最佳培养时间，并用作后续摇瓶培养条件优化研究的发酵终止时问。

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