液相色谱-串联质谱法测定乳制品中四种常用香料（一）

乳制品是非常重要的营养补充，是日常饮食的重要组成部分，对增强国民身体素质具有重要的意义，尤其是婴幼儿乳粉作为婴幼儿阶段的主要营养来源，更是人们关注的重点。香兰素和乙基香兰素具有强烈的奶香味，麦芽酚和乙基麦芽酚是广谱香味增效剂，此四种香料广泛用于各种具有奶香味的食品中。乳制品中添加食用香精香料可以提高食品的风味，但长期食用添加香精的奶粉可能使新生儿对其产生依赖性，过量摄入会引发潜在的健康问题，因此香精香料的超范围及过量使用问题日益引起人们的关注。国家卫计委发布实施的GB2760-2014《食品添加剂使用标准》中明确指出不得添加食用香料、香精有27种食品，其中包括巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳、无水黄油、稀奶油和婴幼儿配方乳粉等多种乳制品。因此，建立灵敏度高、准确可靠的乳制品中4种常用香料的检测方法对乳制品质量安全监管具有重要意义。

目前，此四种化合物同时检测的方法主要有分光光度法，高效液相色谱法，二维液相色谱法，气相色谱-质谱法，液相色谱-串联质谱法等。其中，分光光度法和液相色谱法检测限较高，多种乳制品中要求不得添加食用香精，较高的检测限可能会导致低含量的添加样品无法检出；气相色谱-质谱法分析时间较长；液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、特异性强、分析速度快等优点，广泛应用于食品中香料物质的检测。然而，在LCMS/MS分析中，基质效应严重影响定量分析的准确度和精密度，目前文献报道LC-MS/MS测定乳粉中四种常用香料化合物均存在较强的基质效应，需采用基质匹配曲线或者内标法进行定量分析，大大增加了检测成本，此外，前处理过程需要对净化液进行浓缩，而挥发性较强的香料化合物在浓缩过程中易损失。受酚类化合物可采用酸碱分配法净化的启发，本文采用水-醚体系对乳制品样品进行提取，经碱液反萃除去杂质后采用高灵敏度高选择性的液相色谱串联质谱分析四种化合物。通过研究不同比例碱醚比的碱液反萃醚相中的香料化合物，实现样品净化和富集同步进行，整个过程无需氮吹浓缩，避免挥发性较强的香料化合物在氮吹浓缩过程中损失，以期建立一种灵敏度高、简便快捷、准确可靠的乳制品中四种常用香料的检测方法，为相关部门建立相关测定标准提供参考，保障乳制品的质量安全。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、乙腈、叔丁基甲醚　色谱纯，美国TEDIA公司；甲酸　色谱纯，德国CNW公司；盐酸、氢氧化钠、氨水、无水硫酸钠分析纯，广州化学试剂厂；麦芽酚（纯度≥99%）、乙基麦芽酚（纯度≥99%）、香兰素（纯度≥98%）、乙基香兰素（纯度≥98%）美国Sigma公司；乳制品样品（包括婴幼儿配方乳粉、炼奶、黄油、奶酪、鲜牛奶、纯牛奶、稀奶油、酸奶等共15份）均购自海口市本地大型超市。

色谱柱：HSST3色谱柱（100mm×2.1mm，2.5μm）、BEHC18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm）、HLB固相萃取柱（100mg，3mL）、TQD超高效液相色谱-质谱联用仪，美国Waters公司；PXA固相萃取柱，（150mg，6mL）迪马公司；KQ3200DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MS3涡旋仪，德国IKA公司；320R低温离心机，德国Hettich公司；AdvantageA10超纯水净化仪，美国Millipore公司；GenevacEZ-2型溶剂蒸发工作站，英国SPScientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

奶粉、奶酪、炼奶、黄油等类固体乳制品：称取2g试样（精确至0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，加入5mL50℃的水（黄油样品置于100℃烘箱中加热使之溶解，炼奶用4mL水溶解），3000r/min涡旋混匀2min，40℃下超声提取15min，超声频率为37kHz，再加入20mL叔丁基甲醚，3000r/min涡旋混匀3min，再加入10g无水硫酸钠除水，3000r/min涡旋混匀2min，9000r/min离心3min，吸取上清液10mL转移至另一离心管中，再加入2mL0.2mol/L氢氧化钠溶液反萃，3000r/min涡旋混匀1min后，3000r/min离心3min，用移液器准确移取下层清液0.9mL至刻度试管中，加甲酸定容至1.0mL过0.22μm微孔滤膜，供液相色谱-质谱测定。

过柱净化富集过程：吸取上清液5mL转移至另一离心管，加入5mL0.2mol/L氢氧化钠溶液反萃，去掉上清液，40℃下用GenevacEZ2溶剂蒸发工作站浓缩20min，除去微量的叔丁基甲醚。

HLB过柱方法：除醚后用盐酸调节pH至3.0，先后加入3mL甲醇，3mL超纯水活化固相萃取柱，然后全部上样，样液体积约为4.5mL，重力过柱后，用5mL纯水淋洗，弃去淋洗液，接着用5mL注射器抽干，最后用1mL甲醇洗脱。

PXA过柱方法：先后加入3mL甲醇，3mL超纯水活化固相萃取柱，然后全部上样，样液体积约为4.5mL，重力过柱后，分别用3mL5%氨水甲醇和3mL甲醇淋洗，抽干，最后用1mL5%甲酸甲醇洗脱。

巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳、稀奶油等液体乳制品，直接称取5g试样于50mL聚丙烯离心管中，再加入20mL叔丁基甲醚提取，后处理步骤同奶粉等样品。

1.2.2 色谱-质谱条件　

色谱柱：HSST3色谱柱（100mm×2.1mm，2.5μm，Waters）；流速：0.4mL/min；进样体积：3μL；柱温：30℃；流动相，A相为甲醇，B相为0.05%甲酸水，梯度洗脱程序为0～1.0min，10%～25%A，1.0～5.0min，25%A，5.0～5.1min，25%～60%A，5.1～6.0min，60%A，6.0～6.1min，60%～90%A，6.1～7.0min，90%A，7.0～7.1min，90%～10%A，7.1～8.0min，10%AMS条件：电喷雾正离子源（ESI+），毛细管电压：3.0kV，离子源温度：150℃，脱溶剂管温度：350℃，雾化气：150L/hr氮气，干燥气：650L/hr氮气，碰撞气：氩气。扫描模式：多反应监测模式（MRM），带星号离子为定量离子。

1.3 数据处理

通过Masslynx工作站及数据处理系统采集分析质谱图，外标法定量。试验结果采用平均值表示，每个试验平行三次，采用Excel2010进行数据处理。

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