薄层色谱法鉴别槐枝及高效液相色谱法测定其中芦丁含量（一）

槐枝为常用中药，最早收载于《别录》，《新修本草》中又名嫩槐枝，为豆科植物槐的嫩枝，具有散瘀止血，清热燥湿，祛风杀虫之功效，主治崩漏、赤白带下、痔疮、阴囊湿痒、心痛、目赤、疥癣等，每年4～5月采收，晒干或鲜用。可煎汤、浸酒或烧灰内服，亦可煎水熏洗、烧沥涂。

槐枝含有较多的黄酮类化合物，临床上常用于治疗咽炎、中耳炎、脓疱疮等，其中芦丁为主要药效成分。芦丁又称芸香苷，是一种存在于多种植物中的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和免疫调节等药理作用，因此用芦丁含量作为测定槐枝的质量控制指标具有重要意义。

槐枝在历版国家标准、《山东省中药材标准》及《山东省中药饮片炮制规范》中均未收载，在部分省级标准中有收载。但是检验项目及内容比较单一，有的地方标准中无检验项目，有的地方标准中检验项目有性状、显微鉴别、薄层鉴别及常规的药材检查项目。上述标准中均无含量测定方法，《辽宁省中药材标准：第二册》2019年版中薄层鉴别前处理方法复杂，展开剂用到易制毒试剂丁酮，因此优化槐枝的薄层色谱鉴别方法及建立高效液相色谱法测定芦丁含量具有重要意义。
目前文献中对槐枝的质量评价多采用其高丽槐素、芦丁、槲皮素以及挥发油的含量作为评价指标。但成丽等采用高效液相色谱法测定槐枝中高丽槐素含量，方法重现性好，但是因为高丽槐素对照品制备繁琐，不利于广泛普及。陈华国等采用高效液相色谱法同时测定槐枝中芦丁和槲皮素含量，以甲醇–0.01mol/L乙酸铵(体积比为47∶53)混合溶液为流动相，流动相中需要加入盐溶液，配制比较复杂，操作不当容易阻塞色谱柱，损坏高效液相色谱仪。熊维政等利用高效液相色谱法测定国槐槐枝及槐叶中芦丁含量，并进行了比较，采用的流动相配制简便，但是样品提取过程中没有考察溶剂的影响，不能精准地测定槐枝中芦丁含量。赵超等以芦丁为对照品，利用分光光度法测定槐枝中总黄酮类含量，标准曲线的绘制及样品处理过程繁琐，操作复杂。张艳焱等采用水蒸汽蒸馏法分别提取新鲜和干燥槐枝中的挥发油，用气相色谱–质谱联用法分析和鉴定其化学成分，方法对仪器及操作者水平要求较高，不适用于槐枝的日常检验。

笔者收集了10批槐枝饮片样品，以芦丁含量为评价指标，对样品提取条件、薄层色谱展开剂、色谱条件进行了优化，建立了槐枝的薄层色谱鉴别法及高效液相色谱法测定其中芦丁含量的方法。该方法操作简单、分离度好、经济环保，准确度高，为槐枝质量控制相关标准的建立奠定了研究基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC–20AT型，LCsolution工作站，岛津企业管理（中国）有限公司公司。数控超声波清洗器：KQ–600GDV型，昆山市超声仪器有限公司。高速万能粉碎机：FW100型，天津市泰斯特仪有限公司。电子天平：MS204TS型，感量为0.01mg，瑞士梅特勒–托利多仪器公司。芦丁对照品：批号为100080–201811，含量（质量分数）为91.7%，中国食品药品检定研究院。硅胶G薄层板，青岛海洋化工厂分厂。甲醇：色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司。冰醋酸：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。槐枝饮片样品：10批，编号分别为1～10，均为豆科植物槐SophorajaponicaL.的嫩枝，经干燥，切片制得，产地均为山东。其余试剂均为分析纯。实验用水为纯净水。

1.2 薄层色谱鉴别

1.2.1 对照品溶液制备

取芦丁对照品适量，加入甲醇溶解，配制成芦丁的质量浓度为2mg/mL的对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液制备

称取2g槐枝粉末（过二号筛，筛孔直径为2000μm），加入30mL石油醚（30～60℃）超声处理（500W，频率40kHz）20min，过滤，弃去滤液，滤渣挥干溶剂后，加入50mL甲醇超声处理（500W，频率40kHz）30min，过滤，取滤液蒸干，残渣加入2mL甲醇溶解，所得溶液即为供试品溶液。

1.3 高效液相色谱法测定

1.3.1 色谱条件

色谱柱：KromasilC₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm，瑞典诺力昂公司）；流动相：甲醇–1%冰醋酸溶液（体积比为32∶68）；检测波长：257nm；流量：1.0mL/min；柱温：36℃；进样体积：10μL。

1.3.2 对照品溶液制备

精密称取芦丁对照品0.10282g，置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至标线，摇匀，过滤，取续滤液2mL，置于250mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至标线，摇匀，配制成芦丁的质量浓度为15.1μg/mL的对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液制备

精密称取槐枝粉末（过二号筛）约0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50mL，密塞，称量并记录质量，超声处理（500W，频率40kHz）30min，冷却，再次称量质量，用50%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，过滤，续滤液即为供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 薄层色谱鉴别条件选择

按照《中国药典》2020年版槐米的薄层鉴别方法，选择1号槐枝样品粉末（过二号筛）2g，加入50mL甲醇超声处理（500W，频率40kHz）30min，过滤，取滤液蒸干，残渣加入2mL甲醇溶解，作为供试品溶液。按1.2.1方法制备对照品溶液。按照薄层色谱法（2020年版《中国药典：四部》　通则　0502）试验方法，分别吸取供试品溶液和对照品溶液各2μL和5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯–甲醇–水（体积比为8∶1∶1）溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，待乙醇挥干后，置于紫外光灯（365nm）下检视，结果如图1所示。由图1可以看出，供试品色谱图中，沿着展开过程，有明显的未完全分离的荧光斑条，在与对照品色谱图相应的位置上，有相应的未分离完全的荧光斑点，点样量2μL及5μL无明显区别，结果表明，供试品色谱图中，虽然含有芦丁，但是因为样品杂质较多，提取条件或展开剂选择不恰当，导致斑点未完全分离。

考虑到槐枝样品中含有色素等极性较大的物质较多，先对样品进行脱色处理。称取3份槐枝粉末（过二号筛）样品，各2g，分别加入石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90℃）、乙醚各30mL，分别超声处理20min；再称取3份槐枝粉末（过二号筛）样品，各2g，分别加入石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90℃）、乙醚各30mL，分别回流提取20min，将处理后的6份样品分别过滤，弃去滤液，滤渣挥干溶剂后，加入50mL甲醇超声处理（500W，频率40kHz）30min，过滤，取滤液蒸干，加入2mL甲醇使残渣溶解，制得6份供试品溶液。以乙酸乙酯–甲醇–水（体积比为8∶1∶1）溶液为展开剂，考察不同提取溶剂及提取方法的展开效果，结果发现以石油醚（30～60℃）、超声处理20min展开结果最好，供试品色谱图在与对照品色谱图相应位置上，能显示出相同颜色的斑点，但是斑点有拖尾。在展开剂中加入少量甲酸，斑点分离效果好，无拖尾现象，故样品提取方法选择先加入石油醚（30～60℃），超声处理20min，然后加入50mL甲醇提取，展开剂选择乙酸乙酯–甲醇–甲酸–水（体积比为8∶1∶1∶1）溶液。

相关链接：乙醚，乙酸乙酯，石油醚，芦丁

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