D/L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌及其生物膜的作用（一）

目的：研究D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌及其生物膜的作用｡方法：通过CCK-8实验获得无细胞毒性的D-缬氨酸浓度；通过生长曲线实验评估D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌细菌活性的作用；通过结晶紫染色实验､胞外多糖实验和扫描电镜评估D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的抑制作用和对成熟牙龈卟啉单胞菌生物膜的分散作用｡结果：D-缬氨酸在浓度为50mmol/L和75mmol/L时对成纤维细胞无细胞毒性；D-缬氨酸(75mmol/L)能有效抑制牙龈卟啉单胞菌的细菌活性和生物膜的形成，并分散成熟的生物膜｡D-缬氨酸(50mmol/L)在72h内抑制牙龈卟啉单胞菌的生物活性和生物膜的形成｡L-缬氨酸(75mmol/L和50mmol/L)促进牙龈卟啉单胞菌的细菌活性和生物膜的形成｡当D-缬氨酸和L-缬氨酸同时存在时，仅表现出D-缬氨酸的作用｡结论：D-缬氨酸具有抑制牙龈卟啉单胞菌细菌活性和生物膜形成，并分散成熟生物膜的作用；L-缬氨酸能促进牙龈卟啉单胞菌的细菌活性和生物膜的形成，但其作用与D-缬氨酸不相拮抗｡D-缬氨酸可作为治疗菌斑生物膜相关疾病的潜在生物制剂｡

种植体周围炎和牙周炎是造成种植体脱落和牙体缺失的主要疾病，种植体周围炎和牙周炎的治疗是维护口腔健康的关键｡致病菌菌斑生物膜的形成是种植体周围炎和牙周炎的始动因素，生物膜形式致病菌的致病性和耐药性是游离致病菌的500倍｡牙龈卟啉单胞菌是种植体周围炎和牙周炎的主要致病菌｡牙龈卟啉单胞菌通过分泌脂多糖，牙龈蛋白酶和凝血酶等细胞外基质紧密连接成膜状结构抵抗宿主免疫反应，对牙龈卟啉单胞菌生物膜的清除，是治疗种植体周围炎和牙周炎的关键｡临床上对其治疗方法主要有机械清理菌斑､激光治疗和联合抗生素药物治疗｡然而，机械处理和不适当波长的激光易破坏种植体表面和牙齿表面结构，影响上皮的再附着｡联合抗生素治疗在临床上具有一定的效果，但抗生素的应用可能造成耐药菌株突变仍是不容忽略的问题｡因此，寻找一种有效控制致病菌斑并不产生细菌耐药性的生物制剂对种植体周围炎和牙周炎的治疗至关重要｡

近年来，D-氨基酸与L-氨基酸对细菌及其生物膜的作用成为研究热点｡氨基酸是组成生命物质的基本结构，不会造成细菌基因突变而产生耐药菌株｡学者提出，L-氨基酸能促进细菌活性和菌斑生物膜的形成｡作为L-氨基酸的手性异构分子，我们猜想D-氨基酸可能抑制细菌活性和抑制菌斑生物膜的形成｡本项目组前期研究发现，在共培养3天时，D-缬氨酸(50~150mmol/L)可以抑制牙龈卟啉单胞菌菌斑生物膜的形成，并呈现浓度依赖性｡但D-缬氨酸的细胞毒性尚未被报道｡D-缬氨酸作用于细菌或仅抑制菌斑生物膜的形成仍不明确，D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌及其生物膜的作用亦未被阐述｡本研究拟通过CCK-8实验探讨D-缬氨酸的细胞毒性；通过探讨D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌及其生物膜的作用，获得能有效抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成和分散成熟生物膜的D-缬氨酸浓度｡以期为D-缬氨酸作为治疗种植体周围炎和牙周炎的潜在生物制剂提供理论基础｡

1材料与方法

1.1D/L-缬氨酸培养基的配制与实验分组细胞实验：D-缬氨酸(D-valine，D-val)溶解于细胞培养基中(50/75/100/125/150mmol/L)，经0.22μm滤器过滤备用，对照组为单纯细胞培养基｡细菌实验：D-缬氨酸与L-缬氨酸(L-valine，L-val)溶解于牙龈卟啉单胞菌培养基中，浓度和分组如下：D-val/50mmol/L，L-val/50mmol/L，D-val+L-val/50mmol/L+50mmol/L，D-val/75mmol/L，L-val/75mmol/L，D-val+L-val/75mmol/L+75mmol/L，对照组为单纯牙龈卟啉单胞菌培养基｡

1.2D-缬氨酸细胞毒性实验小鼠成纤维细胞(L929)100μL以浓度5×104Cells/mL培养于96孔板｡培养1d后换液为含有不同浓度D-缬氨酸的培养基继续培养，每天换液｡在培养后的第1､3､5天，通过CCK-8实验检测不同浓度的D-缬氨酸对小鼠成纤维细胞细胞增殖的影响｡无细胞毒性的D-缬氨酸浓度用于后续研究｡

1.3D/L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌活性的影响不同浓度的D-缬氨酸与L-缬氨酸与对数生长期的牙龈卟啉单胞菌(1.0×108CFU/mL，A=600)共培养于试管中，紫外分光光度计在600nm波长下每12h测定其浊度，持续至144h，记录实验数据并绘制时间-生长曲线｡

1.4生物膜形成量实验采用传统的结晶紫染色实验评估生物膜的形成和成熟生物膜的分散情况｡生物膜形成抑制实验：将不同浓度的D-缬氨酸与L-缬氨酸与对数生长期的牙龈卟啉单胞菌共培养于96孔板内(1.0×108CFU/mL，A=600)，每组5个副孔，分别在培养3d和5d后采用结晶紫染色法评估D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的作用｡成熟生物膜的分散实验：对数生长期的牙龈卟啉单胞菌96孔板内培养(1.0×108CFU/mL，A=600)，3d后形成成熟的牙龈卟啉单胞菌生物膜｡去掉培养基保留孔板底部生物膜，更换含不同浓度的D-缬氨酸与L-缬氨酸的培养基培养3d，采用结晶紫染色法评估D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜的分散作用｡

1.5胞外多糖实验和扫描电镜观察生物膜结构采用硫酸-苯酚法测定胞外多糖，本实验中紫外分光光度计和酶标仪标定波长为490nm｡以不同浓度葡萄糖(0､10､20､30､40､60､80､100mg/L)绘制多糖标准曲线｡扫描电镜观察生物膜结构实验中紫外分光光度计标定波长为600nm，采用24孔板培养牙龈卟啉单胞菌｡生物膜形成抑制实验与成熟生物膜的分散实验分组及培养方式同结晶紫染色实验｡实验步骤和操作方法同项目组前期研究｡

1.6统计学分析使用SPSS24.0进行统计学分析，检测数据正态分布后，组间比较才有用方差分析，以P<0.05为有统计学意义｡使用Prism-graphpad8.0进行数据分析和统计图绘制｡

声明：本文所用图片､文字来源《口腔医学研究》2020年7月第36卷第7期，版权归原作者所有｡如涉及作品内容､版权等问题，请与本网联系

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