乙醇浸提法提取南极磷虾多酚物质研究（一）

南极磷虾，属节肢动物门甲壳亚门磷虾目磷虾科，又名大磷虾或南极大磷虾，广泛分布于南冰洋的南极洲海域，是南极生态系统的关键物种。南极磷虾的蕴藏量极为丰富，约在6.5～10亿吨之间，且主要生活在浅层海域，捕捞难度小，极具商业开发潜力南极磷虾具有典型的高蛋白、低脂肪的特点，包含8种人体必需氨基酸，矿物质、维生素含量丰富，并且含有多种活性成分如多酚、生物酶、虾青素、甲壳素等，具有广阔的开发应用潜力。
多酚类物质的分子结构中含有多个酚羟基基团，其酚羟基可与金属离子发生络合反应，是一类有很高抗氧化活性的天然产物，在化学、生物、食品、药学等多个领域均有广泛的应用前景。多酚类物质在自然界的储量非常丰富，已发现植物中有8000余种多酚类化合物及其衍生物。现有文献对植物多酚的研究很多，但从动物体内提取多酚类物质的研究则鲜有报道。本研究以富有开发潜力的海洋生物资源南极磷虾为原料，采用乙醇浸提法提取南极磷虾体内的多酚物质，且通过响应曲面优化确定最佳提取方案，以期为进一步研究南极磷虾中多酚物质的成分及功能提供实验基础。

一、材料和方法

1、材料与试剂

南极磷虾粉，日本水产有限公司。乙醇、丙酮、福林酚试剂、无水碳酸钠、没食子酸等均为分析纯试剂。实验用水为蒸馏水。

2、设备与仪器

Eppendorfminispan型离心机；恒温水浴振荡器；酶标仪；电子天平。

3、实验方法

（1）样品总酚含量测定

吸取1mL待测样液，加入0.5mL福林酚试剂，充分震荡后静置3～4min，再分别加入0.5mL10%碳酸钠溶液，定容至10mL，摇匀置于25℃恒温水浴中反应1h，以空白试剂为对照，765nm条件下测定吸光度。

（2）总酚标准曲线

精确称取0.01g烘干至恒重的没食子酸标准品，溶解于蒸馏水中并定容至200mL。得浓度为0.05mg／mL的标准溶液。

准确量取0.05mg／mL的标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中，加入0.5mL福林酚试剂，充分震荡后静置3～4min，再分别加入0.5mL10%碳酸钠溶液，蒸馏水定容至10mL，摇匀置于25℃恒温水浴中反应1h，以空白试剂为对照，765nm条件下测定吸光度，建立标准曲线。

（3）总酚含量与提取得率计算

按以下公式换算总酚含量（以没食子酸的相当值表示）:

式中:ω-总酚含量，mg／mL；C-没食子酸质量浓度，mg／mL；V-提取液体积，mL；N-稀释倍数；M-取样量，mL。

按以下公式计算南极磷虾总酚提取得率：

式中:Y-南极磷虾总酚提取得率，mg／g；ω-提取总酚含量，mg／mL；V-提取液体积，mL；M'-南极磷虾质量。

（4）南极磷虾多酚提取条件的确定

①乙醇浓度的选择实验

分别采用不同体积分数（0%、20%、40%、60%、80%、100%）的乙醇-水提取液，在物料比1:5、提取温度25℃、提取时间1h条件下，提取南极磷虾中的多酚物质，并计算多酚提取得率。

②提取时间选择实验分别采用不同的

提取时间（15min、30min、60min、120min、180min、240min），在物料比1:5、以80%乙醇为溶剂、提取温度35℃提取条件下，提取南极磷虾中的多酚物质，并计算多酚提取得率。

③提取温度选择实验分别采用不同的

提取温度（15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃），在物料比1:5、以80%乙醇为溶剂提取1h条件下，提取南极磷虾中的多酚物质，并计算多酚提取得率。

④物料比选择实验

分别以1:3、1:5、1:7.1:9、1:11、1:13的料液比，在以80%乙醇为溶剂、提取温度35℃、提取时间60min条件下，提取南极磷虾中的多酚物质，并计算多酚提取得率。

⑤响应面确定最优提取条件实验采用

Box-Behnken实验设计原理，以乙醇浓度、提取时间、提取温度及物料比4个因素为自变量，多酚提取率为响应值，设计四因素三水平试验（表1）。对实验数据进行多项式回归分析，建立二次响应面分析模型，拟合得到二次回归方程。进行27组响应面优化实验，每个实验组重复3次，求取平均值，以确定最佳提取条件。

二、结果与讨论

1、单因素实验

（1）乙醇浓度的选择

不同乙醇浓度对多酚提取得率的影响见图1。图1表明，提取溶剂乙醇体积分数为80%时多酚提取得率最高，体积分数为40%时多酚提取得率最低。其原因可能是南极磷虾体内的动物类型多酚与磷虾油键结合形成天然活性多效能复合分子，溶剂水不能使多酚与其他物质连接的氢键断裂，加入乙醇可以破坏氢键，乙醇含量达到一定浓度后，随着乙醇浓度的增高，加速氢键断裂使得多酚得率提高；但乙醇浓度过高会使得多酚与溶剂的极性差异变大，多酚溶解度下降，导致多酚提取得率降低。根据实验结果，本文选用80%的乙醇-水溶液作为提取溶剂。
 

（2）提取时间的选择

提取时间对提取效果的影响如图2所示。图2表明，60min内随着提取时间的增加，南极磷虾多酚得率显著增加；60min后得率逐渐下降。其原因可能是在60min以内，细胞内多酚快速扩散到溶剂中，得率增加。随着提取时间的进一步增加，部分多酚被氧化分解，造成得率下降。因此，理想的提取时间为60min，此时多酚提取率最高。

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