油茶叶提取物的5α-还原酶抑制活性及化学成分分析（一）

发布时间：2021-05-09 20:12 编辑者：夏德婷

5α-还原酶（5α-Reductase,5α-R）是重要的雄性激素代谢酶，睾酮（Testosterone,T）在5α-还原酶（5α-R）的作用下不可逆地转化双氢睾酮（Dihydrotestosterone,DHT），过程中还要依赖还原性辅酶II（NADPH），如图1所示。DHT是最强的活性雄性激素，因为它与雄性激素受体（Androgenreceptor,AR）的亲和性比T高2~5倍，诱导AR信号传导的效力比T高10倍可引发雄性激素依赖性疾病比如痤疮、雄激素源性脱发、女性多毛症、前列腺癌、前列腺增生、假两性畸形等。

5α-R是皮肤中最重要的雄性激素代谢酶，它具有三种同工酶，其中I型和II型酶的特征比较清楚，二者的主要区别为5α-RI主要存在于肝脏及非生殖器官皮肤，其发挥生理作用的最适pH为范围较宽为6~9，而5α-RII主要存在前列腺、睾丸、附睾、精囊、头皮毛囊等，其最适pH为5.5。

目前已开发的5α-R抑制剂包括甾体类和非甾体类，最常见药物如非那雄胺、度他雄胺、爱普列特等。但这些药物存在不良反应，如代表性药物非那雄胺可能对男性造成，抑郁、焦虑、认知障碍、勃起障碍、性欲减退、男性乳房女子化、肌肉生长受损等副作用，统称为非那雄胺后综合征（Post-finasteridesyndrome,PFS）。

这些副作用是这类药物本身固有的，难以通过改造结构来消除，因此从天然植物中寻找安全、有效且来源广泛的5α-R抑制剂替代这些化学合成的抑制剂己成为国内外研究的热点。Niederprüm等通过体外实验证实了锯叶棕果实提取物具有5α-R抑制活性以及治疗前列腺增生的效果。WeisserH等发现锯叶棕提取物IDS89对人前列腺上皮和间质中的5α-R具有抑制作用，且属于非竞争性抑制，有效成分是可皂化亚组分中的月桂酸，它对上皮和基质的最大抑制率分别为52％和45％。邓桂球等从雌性大鼠肝脏、雄性大鼠附睾组织中分别提取I型、Ⅱ型5α-R，采用HPLC法测定出红花提取物对I型、Ⅱ型5α-R活性均有抑制效果，抑制率分别达到88.12%和61.65%。另外也有研究报道大黄非洲臀果木、大荨麻、薰衣草、莲子心等植物的提取物具有良好的5α-R抑制活性，是天然来源的5α-R抑制剂。

油茶叶是山茶科植物油茶CamelliaOleifera的叶，《中华本草》中提到其味微苦，性平，有治疗鼻衄，皮肤溃烂瘙痒，疮疽的功效。罗晓伟等已经证明油茶蒲具有5α-R抑制活性，油茶叶与油茶蒲同为油茶的重要组成部分，推测油茶叶与油茶蒲可能具有类似的生物活性。本文以5α-R为研究靶点，旨在探究油茶叶提取物对5α-R活性的影响，探讨其成为潜在的5α-R抑制剂的可能性，并分析其化学成分，为其在治疗雄性激素依赖型疾病如痤疮、前列腺癌等提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜采摘的油茶叶，浙江省江山市江山之间生物科技有限公司提供；SPF级别雄性大鼠4只，体重（200±20）g，由浙江省医学科学院提供，许可证编号SCXK（浙）2019-0002；还原型辅酶II，Bradford蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天；度他雄胺、睾酮、没食子酸、芦丁分析对照品，上海阿拉丁；色谱级甲醇等有机试剂均来自国药集团化学试剂有限公司。

高效液相色谱Waterse2695，美国Waters公司沃特世；LunaC18(2)色谱柱（4.6mm×250mm,5μm），美国Phenomenex公司；UltimateUHPLCLP-C18色谱柱（2.1mm×150mm,1.8μm），上海月旭；AcquityTMUltra型超高效液相色谱仪，美国Waters公司；SciexTripleTOF5600+四级杆飞行时间质谱仪，美国ABSciex公司。

1.2实验方法

1.2.1粗酶提取物的制备以及5α-R含量的测定

参考张蓓的方法并稍作修改，取雄性大鼠4只，禁食不禁水过夜后脱臼处死。迅速取肝脏，剥离脂肪组织，称重，剪碎，置于烧杯，加入预冷的提酶缓冲液（提酶缓冲液：0.32mol/L蔗糖；0.1mmol/LDTT；1mmol/LEDTA；20mmol/L磷酸盐缓冲液pH7.4）按照1:4（w/v）的比例在冰水浴中用匀浆器匀浆，制成匀浆液，然后将其分装至离心管，在4℃、10,000×g条件下离心20min，除去漂浮的脂肪，取上层液体，同样条件下再离心1h，上清液即为微粒体粗提取物。采用Bradford法对粗酶提取物定量，以其总蛋白质含量表示5α-R的含量。

1.2.25α-R酶促反应体系的建立与5α-R活性测定

1.2.2.1T标准曲线的制备

配制系列浓度T溶液：5μmol/L~2000μmol/L，将不同浓度T溶液用0.22μm微孔滤膜过滤至液相瓶，进入高效液相色谱仪检测，以峰面积A（AU*min）为纵坐标，以T浓度C（μmol/L）为横坐标，绘制标准曲线。

液相色谱条件：

色谱柱：LunaC18(2)柱（4.6mm×250mm,5μm）不锈钢柱；柱温：30℃；流动相：甲醇/水70/30（V/V）；流速：1.0mL/min；检测波长：242nm；进样体积：20μL。

1.2.2.25α-R酶促反应体系的建立

在1000μL测活体系中，将300μLPBS缓冲液（pH7.4）、500μL粗酶提取物稀释液、50μLT、50μL50%乙醇、100μLNADPH按顺序添依次加至离心管，于旋涡混合仪快速混合均匀3s，37℃恒温水浴锅反应30min，在t0时刻与t30时刻快速分别取样400μL，快速加入800μL甲醇（甲醇起到失活蛋白酶的作用），涡旋5s终止反应。上述反应液在12,000r/min离心15min，除蛋白，取上清液，0.22μm有机相滤膜过滤至液相瓶，待检测。

1.2.2.35α-R活性测定

HPLC检测比较反应前t0时刻与反应后t30时刻T峰面积的变化，液相色谱条件同1.2.2.1。将T峰面积带入T标准曲线，计算出相应浓度，以及T浓度的变化量，从而实现测定5α-R的活性。设置不同的反应管包括：空白对照管（酶提取物用甲醇失活）、酶正常反应管、阳性对照管（50%乙醇换成度他雄安溶液）。

计算公式如下：

△T（μmol/L）=Ct0–Ct30（1）

Ct0表示0min时T浓度，Ct30表示30min时T浓度，△T表示反应前后T浓度的差值。

5α-R活性（μmolT/gprot·30min）=（Ct0–Ct30）/C5α-R（2）

定义5α-R活性（μmolT/gprot·30min）为每克酶提取物每30min转化T的量，C5α-R（g/L）表示5α-R粗提取物的浓度，即5α-R粗提取物蛋白质的浓度。

1.2.35α-R酶促反应体系的优化

1.2.3.1反应体系中NADPH、T、粗酶提取物适宜添加浓度的确定

将NADPH用PBS配制成一系列梯度：0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L，采用1.2.2中提到的5α-R活性测定方法，在固定5α-R提取物浓度为0.76mg/mL、T浓度为1mmol/L的条件下，以5α-R活性为指标，考察NADPH的适宜添加浓度。

将T配制成一系列梯度：0.025mmol/L、0.1mmol/L、0.4mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L，采用1.2.2中提到的5α-R活性测定方法，在固定5α-R提取物浓度为0.76mg/mL，NADPH浓度为2mmol/L的条件下，以5α-R活性为指标，考察T的适宜添加浓度。

以蛋白质浓度表示粗酶提取物的浓度，将其用PBS（pH7.4）缓冲液稀释成系列梯度：0.38mg/mL、0.76mg/mL、1.52mg/mL、3.03mg/mL、6.06mg/mL，采用1.2.2中提到的5α-R活性测定方法，在固定T浓度为2mmol/L，NADPH浓度为2mmol/L的条件下，以5α-R活性为指标，考察粗酶提取物的适宜添加浓度。

1.2.3.2反应体系稳定性的考察

确定最终反应体系各个组分的浓度条件：76mg/mL粗酶提取物500μL，2mmol/LT50μL，样品50μL，2mmol/LNADPH100μL，分别测定四次空白对照管和酶正常反应管的T浓度变化，考察反应体系的重复性和稳定性，计算相对偏差RSD。

1.2.3.3度他雄胺5α-R抑制活性的测定

度他雄胺是Ⅰ型5α-R抑制剂，将其为阳性药物并稀释成系列梯度：2nmol/L、4nmol/L、6nmol/L、8nmol/L、12nmol/L、16nmol/L，采用1.2.2中提到的5α-R活性测定方法，在适宜的NADPH浓度、T浓度、粗酶提取物浓度条件下，把50%乙醇溶液替换成系列浓度的度他雄胺溶液，考察不同浓度度他雄胺对5α-R活性的抑制率，绘制抑制曲线，计算出度他雄胺对5α-R活性的半抑制浓度（IC50），公式如下：