油茶叶提取物的5α-还原酶抑制活性及化学成分分析（二）

发布时间：2021-05-09 20:22 编辑者：夏德婷

1.2.4油茶提取物的制备及5α-R抑制活性的测定

1.2.4.1不同溶剂油茶叶提取物的制备及得率的计算

油茶叶去除病变经过挑选，45℃烘箱干燥，粉碎过60目筛，称取8份20g油茶叶粉末按1:40（w:v）料液比分别加入水、50%乙醇溶液、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚，先搅拌浸泡3h再于50℃下超声振荡提取两次（2h/次），4000r/min离心10min使得固液分离，上清液旋转蒸发减压浓缩除去有机试剂，然后真空冷冻干燥，得到不同极性溶剂的油茶粗提取物分别记为A1-~A8，观察其颜色及性状，并计算得率，计算公式如下：

得率%=100×m//M（4）

式中m为提取物的质量（g），M为原料干基质量（g）。

1.2.4.2油茶叶提取物5α-R抑制活性的测定

分别取A1~A8冻干粉末，用50%乙醇均配制成200μg/mL的稀释液，按照1.2.2测定A1-A8稀释液对5α-R的抑制率，以5α-R抑制率为指标，确定最佳制备溶剂，并测定、计算最佳溶剂提取物对5α-R活性的半抑制浓度（IC50），相关计算公式同公式（3）。

1.2.5油茶提取物总酚和总黄酮含量的测定

用50%乙醇溶液将A1~A8配制成1mg/mL的稀释液，采用Folin-Ciocalteu法，以没食子酸计，测定不同油茶叶提取物中的总酚含量。标准曲线的制备：配制梯度浓度的芦丁溶液0~50μg/mL。在1mL体系中依次加入100μL没食子酸溶液，250μL的福林酚试剂，250μL的15%的碳酸钠溶液，再补足400μL水至1mL终体积。充分混合之后80℃水浴放置30min，静置冷却10min，4000r/min离心5min，取上清液于778nm测定吸光值A778。依据没食子酸标准溶液的浓度和相应的吸光值绘制标准曲线。样品的测定：操作同上，将样品吸光值带入标准曲线，以没食子酸计，算得样品总酚含量。

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法，以芦丁计，测定不同溶剂植物提取物中总黄酮的含量。标准曲线的制备：精密配制梯度浓度的芦丁溶液0~50μg/mL。吸取200μL待测芦丁溶液，置于5mL试管中，加入300μL60%乙醇溶液，再加入100μL亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6min，加入150μL硝酸铝溶液，摇匀，放置6min，加入400μL氢氧化钠溶液，最后加入1.35mL60%乙醇溶液至终体系为2.5mL，摇匀，放置15min，于510nm测定吸光值A510。依据芦丁标准溶液的浓度和相应的吸光值绘制标准曲线。样品的测定：操作同上，将样品吸光值带入标准曲线，以芦丁计，算得样品总黄酮含量。

1.2.6超高效液相色谱串联三重四极杆飞行时间质谱分析（UPLC-TRIPLETOF-MS/MS）分析鉴定油茶叶提取物的化学组分

参考王薇的方法取得8mg油茶叶50%乙醇提取物，加入2mL甲醇，配制成4mg/mL的提取物待测液，超声5min后用0.22μm微孔滤膜过滤至液相瓶中，待测。

色谱柱：C18柱（2.1mm×150mm,1.8μm）；流动相：0.1%甲酸-水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B）；梯度洗脱条件：0~10min，5%~13%B；10~20min，13%B；20~40min，13%~20%B；40~60min，20%~45%B；60~70min，45%~100%B；进样量：10µL；流速：1mL/min；柱温：35℃；检测波长：280nm。

UPLC-TripleTOF5600+飞行时间液质联用仪：负离子扫描模式；扫描范围：m/z100-2000；雾化气（GS1）：55psi；雾化气（GS2）：55psi；气帘气（CUR）：35psi；离子源温度（TEM）：550℃（负）；离子源电压（IS）：-4500V（负）；一级扫描：去簇电压（DP）：100V；聚焦电压（CE）：10V；二级扫描：使用TOFMS-ProductIon-IDA模式采集质谱数据，CID能量为20、40和60V，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2ppm。

1.3数据处理

采用EXCEL软件进行数据分析（各组数据均用±s来表示）；用GraphpadPrism6.0绘制线图、柱状图；相关性分析采用SPSS中Pearson相关性分析统计检验（*P＜0.05）。

2结果与讨论

2.15α-R粗酶提取物蛋白含量

粗酶提取物呈现粉红色，采用Bradford法对5α-R粗酶提取物定量，以蛋白质含量表示。测得蛋白质标准曲线为y=0.5753x+0.5269（y为吸光值，x为标准蛋白浓度，R2=0.9977），算得浓度为12.12mg/mL。

2.2T的标准曲线

如图2所示，T在5μmol/L~2000μmol/L范围内呈现良好的线性关系，回归方程为y=18110x+116886（R²=0.9998）。

2.3酶促反应体系的确定

如图3所示，在0~2mmol/L范围内，随着NADPH浓度的增加，酶活性不断上升，当NADPH浓度再增加时对酶活性的影响不大，而且考虑到NADPH价格昂贵，故最终选择2mmol/L作为NADPH在5α-R酶促反应体系中的适宜添加浓度。如图4所示，在0.1~2mmoL范围内，随着T浓度的增加，酶活性不断上升，选择酶活性最高时对应的2mmol/L作为T在5α-R酶促反应体系中的适宜添加浓度。如图5所示，5α-R提取物浓度在0.38~0.76mg/mL范围时，随着提取物浓度增加，酶活力逐渐上升，在浓度为0.76mg/mL时达到最高值，之后随着提取物浓度的增大酶活力反而降低，因此确定0.76mg/mL为5α-R提取物浓度在5α-R酶促反应体系中的适宜添加浓度。

最终确定的反应条件如下：pH为7.4的磷酸盐缓冲液300μL，添加浓度为0.76mg/mL的粗酶提取物500μL，添加浓度为2mmol/L的T50μL，样品50μL,添加浓度为2mmol/L的NADPH100μL，反应温度为37℃，反应时间为30min。