数字PCR技术在食品检测中的应用研究进展（二）

3食品源性成分的鉴定

由于市场需求扩大和原料价格上涨，部分企业或商家为减少成本获得高利润，加工过程中在食品中加入成本低廉的原料以次充好，因此对于食品源性成分快速准确鉴定的需求与日俱增。目前常用检测方法主要为qPCR法，该方法依赖标准曲线且易被抑制剂影响。数字PCR技术可以弥补这些不足，在检测过程中直接通过每个反应单元中有无荧光信号进行判读，从而计算日标含量，逐渐被应用于食品源性成分鉴定的研究中。

现有文献报道中，利用数字PCR技术检测食品中动、植物源性成分主要有两种技术路线：一种是以DNA浓度为中间值，建立源性成分质量M与DNA拷贝数C之问的线性关系M=AC+B(A、B为常数)，再根据检测结果进行计算。该方法适用于大部分食品中源性成分的检测，可检测原材料复杂的食品中多种目标源性成分。

Cai等所建立的双重(ddPCR方法可同时检测食品中牛肉及猪肉原料，具有良好的特异性和敏感性，在复杂基质的样品中也未观察到荧光干扰现象，与前文所提到深加工食品中转基因水稻检测结果一致，验证了数字PCR方法不易受抑制剂及复杂基质的影响。Shehata等将微滴数字PCR分析与内部控制相结合，可在没有标准曲线的情况对含有0．05％～1.0％(w／w)牛肉、火鸡肉、猪肉、鸡肉等肉类的食品及饲料等进行准确定量检测。

李玮琦等利用火鸡的转化生长因子-β3基因序列，建立了同时适用于cdPCR和ddPCR平台的快速检测方法，两种方法均准确检测多种肉类混合产品中火鸡肉质量占5％及以上的产品，准确性良好，也证实了同一方法在小同数字PCR平台问的通用性。基于这种路线，不仅可以检测肉制品掺假情况，鉴别不同肉制品种类并对其定量，还能对植物源性成分进行检测，并准确定量及定性分析植物饮料中掺假情况。

另一种路线则是根据两种小同源性成分实际拷贝数来计算，不需要以DNA浓度为中间值。以任君安等对羊肉和猪肉的检测为例，通过ddPCR测定单位质量下羊肉和猪肉的基因拷贝数之比k，得到猪肉与羊肉质量之比Mp：Mm=kQp:Qm，(Qp，为猪基因拷贝数，Mp为猪肉质量，Qm为羊基因拷贝数，Mm为羊肉质量)，最后用实际测得的拷贝数来计算羊肉和猪肉的相对质量分数。实验证明数字PCR技术对于羊肉中掺杂猪肉的含量检测具有很好的检测效率，可检测到羊肉中猪肉含量1％的产品，在相对定最检测范围5％～80％(w/w)之间绝对误差小。

该团队还对绵羊及山羊肉产品中鸡肉的含量进行了定最，比qPCR方法更准确；且在不同热处理和高压下均有良好的重复性和稳定性，不同部位的肉对ddPCR方法的定量准确性也没有影响。刘立兵等16通过类似的方法对牛肉/猪肉人工混合样本和市售牛肉制品中的猪肉成分进行定量，结果良好，也证实了该方法的可行性。此外，数字PCR方法还可对食品成分的来源进行鉴定，可用于地理标志产品保护。Scollo等建立ddPCR方法鉴别橄榄油来源并定最DNA拷贝数，最低测量值可达到稀释度10-3，比原有的qRT-PCR方法低一个数量级。

还有研究者在先前研究基础上对银鲳鱼进行鉴别及定量，可准确分辨银鲳鱼及其他具有高度同源序列的鱼类，实验得到ddPCR的绝对检测限为2copies/μL，与其他肉类检测结果的1～5copies/μL相近，对鱼肉及DNA混合物的敏感性分别为0.1％和0.5％(w/w)，且灵敏度是qPCR的156倍。

以上研究表明，在食品源性成分的定性及定景过程中，数字PCR方法可对较低含量成分进行鉴别、定量，灵敏度及稳定性优于qPCR；抑制剂、加工条件及采样部位对其重复性和稳定性影响较小，能够大幅提高食品掺假及食品成分来源鉴别的准确性，为食品抽检及大规模检测提供更高效的方法，进一步推动食品质量与安全管理。但食品加工过程中，长时间高温(超过15min)或超声波处理(超过10min)及分析过程中限制性内切酶的作用会使部分目标DNA降解，影响扩增效率导致最终读数低于实际值，因此在分析过程中需要将DNA降解率降到最低。

4食源性致病微生物快速检测

可引起食源性疾病的微生物是影响食品安全的主要因素之一，如沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌等。这些微生物广泛存在于肉制品、奶制品、水产品、蔬菜等多种食品中，是引起食物中毒的主要致病微生物。尽管食品加工过程中对微生物污染严格控制，但仍无法完全避免食品污染引起的疾病或食品腐败，甚至影响公众健康，同时也为企业造成较大经济损失。因此，对食品原料、加工环境及最终产品中可能存在的微生物进行有效检测至关重要，对确保食品安全性及保障食品品质具有重要意义。

赵丽青等基于单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因建立了ddPCR检测方法，得到计算公式为：初始浓度(CFU/g)=检测数据((copies/μL)×25，检出限可以达到90UFU/mL，灵敏度非常高且重复性好，可高效、准确检测食品中核细胞增生李斯特氏菌。此后，程逸宇等针对乳制品建立了单增李斯特氏菌的检测方法，LOD为5×10²CFU/mL。

赵新等根据沙门氏菌invA毒力基因序列对沙门氏菌进行快速检测并与传统培养法进行对照验证，检测灵敏度可达到10²CFU/mL，模拟污染沙门氏菌的金针菇样品实测与传统国标法对比符合率100％，可以在保障准确性的同时节省大量时问。Wang等在列在其研究中也证明了数字PCR比qPCR节约2h左右预培养时间，且最低检出限可达到10²CFU/mL。

周巍等根据金黄色葡萄球菌nuc基因设计特异性检测体系，利用ddPCR方法对发酵乳中金黄色葡萄球菌nuc基因的检测特异性和灵敏度进行实验，检测限可达到3.3×10¹CFU/g，定最检测结果精确，特异性好。魏咏新等建立的大肠杆菌0157:H7的ddPCR检测技术的最低定量限为4.2拷贝/反应，人工污染食品样品的检测限为11⁰CFU/g，适用于食品中高污染大肠杆菌0157:H7的定量检测应用，为大肠杆菌0157:H7的防控和监管工作提供技术支持。除致病微生物外，酸奶、玫瑰酱等发酵食品中含有大黄益生菌，采用数字PCR技术可对其亚种进行鉴别并测定含量。

与食品行业传统培养法及qPCR方法相比，数字PCR从提取微生物DNA到检测完成仅需1d，且灵敏度、精准性及重复性优于qPCR；数字PCR可使用双蕈引物对微生物进行准确鉴别，也与RT-PCR方法或叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide，PMA)等预处理方式结合，提高检测灵敏度，实现对较少数最活细胞的定景。

数字PCR方法具有通过不同荧光信号、分区及信号通道改进实现对多个目标准确量化的可能性，在对致病微生物单独检测的研究基础上，可以设计针对不同探针或特异性基因片段的体系实现样品中不同致病微生物的同时检测，提升食品安全检测的效率，对食品原料及加工过程中微生物的检测、利用及标准化控制提供有益参考。

采用数字PCR方法仅能对食品中已知致病微生物进行鉴别及定量，对于其他可能存在的未知微生物仍需采用传统培养法进行筛选鉴别。此外，有研究者发现，数字PCR准确定量的检测限优于qPCR一个数量级，但当样品浓度过低时检测结果偏差较大，这可能是由于当样品浓度过低时在体系中过于分散，以致添加模板吸液时各平行样中核酸量有差异。因此在检测前可能需要对样品浓度进行估计，必要时要对样品进行富集。

5前景与展望

与传统方法相比，数字PCR技术在检出限、稳定性等方面具有较大优势，但目前仍存在一些不足：商业化数字PCR仪器设备价格高，且需要芯片、微滴生成油等价格较高的特殊装置来保证大最独立反应单元的形成，提高了检测成本，这也是目前限制数字PCR技术大范围应用的主要因素；数字PCR也是基于普通扩增的原理，无法避免常规PCR过程中也会出现的“假阳性”结果；在操作过程中，生成微滴数最不达标、产生气泡、微滴破裂、引物保存不当、污染等均会影响最终检测结果，对操作人员及检测过程有更高要求。因此，要优化仪器来降低检测成本、对操作人员进行规范化培训以避免操作误差，从而提高数字PCR可用性。

总体而言，数字PCR方法在食品定景及定性分析方面具有巨大潜力，虽然存在一些问题，但随着制造技术的发展、数字PCR仪的优化以及检测人员的专业化系统化培训，数字PCR技术能够在未来为科学研究和实际应用提供更多可能的方法，解决更多难题。数字PCR仪也将逐渐在基层检测及研究机构中投入使用，为食品安全检测、食品质最控制提供高效可行的手段，对于食品检测标准制定及食源性疾病预防具有重要意义。

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