农药残留的酶活性抑制与免疫分析技术的免疫分析法（八）

6、免疫传感器：免疫传感器是以抗体或抗原为生物敏感部件的生物传感器

生物传感器包括一个有特殊生物反应的生物敏感部件和一个能将反应信号转变成电信号的转换器。第一代生物传感器是将固定了生物活性物质(如酶等)的膜(如半透膜等)覆被在电化学电极上形成的；第二代生物传感器是将人工合成的媒介体与生物活性物质掺和后直接吸附或共价结合到转换器表面形成的；第三代生物传感器是将生物活性物质直接固定在电子元件(如半导体场效应晶体管)上形成的，因为可以直接感知和放大界面物质的变化，把生物识别与信号转换结合在一起。由于生物传感器的高度自动化、微型化与集成化，在生物、医学、环境监测、海洋、军事等领域具有重要的应用价值，特别适合于现场和原位监测。以乙酰胆碱酯酶和抗原抗体为生物敏感材料的生物传感器在农药残留免疫分析和污染监测中具有较好的研究开发和应用价值。

免疫传感器根据是否使用标记物分为标记型免疫传感器和非标记型免疫传感器。标记型免疫传感器利用标记物将免疫反应信号放大(如酶促显色反应)或利用标记物信号强度的变化(如荧光增强、荧光猝灭等)对待测物进行检测。非标记型免疫传感器不用任何标记物，直接利用抗原抗体反应所产生的电化学信号(如介电常数、电导率、膜电位等)、光信号(如折射、反射、透射等)等参数的变化对待测物进行检测。

根据信号转换器的不同，免疫传感器分为电化学免疫传感器、压电晶体免疫传感器、热敏免疫传感器、光学免疫传感器、半导体免疫传感器、微悬臂免疫传感器、免疫芯片等。

(1)电化学免疫传感器：电化学免疫传感器分电位型、电流型和电容型。电位型免疫传感器主要指响应抗原抗体反应引起的跨膜电位变化和电极电位变化的免疫电极。电流型免疫传感器通常是指在恒压条件下，检测抗体或(抗原)上标记的酶催化底物发生氧化还原反应产生电流的电极。电容型免疫传感器是建立在双电层理论上的一种传感技术。在给定电势下，当表面修饰有电绝缘膜的金属(或半导体)电极插入待测溶液中时，在电极与溶液界面形成一个类似的电容器，能够储存一定的电荷。以修饰有抗原或抗体的电绝缘膜制备电容型免疫传感器，将这种传感器插入待测溶液中，抗原抗体反应改变了电绝缘膜的介电常数，从而使传感器的电容发生变化，其变化程度与待测物的量在一定范围内线性相关。

(2)压电晶体免疫传感器：压电晶体免疫传感器是将抗原(或抗体)修饰在压电晶体上制成的。在压电晶体表面，抗原抗体复合物的形成引起质量或声波的改变，通过压电晶体将质量信号或声波信号转化为电信号，从而对待测物进行检测。

(3)热敏免疫传感器：热敏免疫传感器是将抗体(或抗原)固定在含热敏电阻的材料上制成的，一般用在酶免疫等具有反应热变化的检测中。在与抗原抗体反应相关的酶促催化反应发生时，可产生20～100 kJ/mol的热量，导致热敏电阻的阻值发生变化，从而引起与热敏电阻相关的电路中电流的变化，依此对待测物进行检测。

(4)光学免疫传感器：光学免疫传感器是将免疫反应与光信号变化检测相结合的传感器件。标记型光学免疫传感器一般用酶或荧光材料作标记物。在酶免疫分析中，通过测定酶促显色反应的强度(吸光度)对待测物进行检测，在荧光免疫分析中通过测定荧光强度的变化对待测物进行检测。非标记型光学免疫传感器是光学免疫传感器的主体。将抗体(或抗原)固定在玻璃、光纤等材料表面，抗原抗体反应导致光的折射率、反射角、透射率等发生变化，这些变化通过光电转换器转化为电信号，对待测物进行检测。在光学免疫传感器中，光导纤维免疫传感器具有体积小、光传输效率和传输密度高、环境适应性和抗干扰能力强、不需要参比信号、灵敏度高等优势，成为光学免疫传感器研究的热点和前沿之一。

(5)半导体免疫传感器：半导体免疫传感器是由生物识别单元(抗原一抗体)与半导体器件(通常是场效应晶体管)相结合研制而成，可以直接响应免疫反应引起的电信号(电流、电容)的变化，从而对待测物进行检测。

(6)微悬臂免疫传感器：微悬臂免疫传感器是将抗体(或抗原)固定在具有纳米金涂层的微悬臂表面，抗原抗体反应的发生导致微悬臂表面性质的变化而使微悬臂发生形变，从而导致与微悬臂相关的光学(如反射、折射等)信号的变化，依此对目标分析物进行检测。

目前在农药残留分析方面，免疫传感器的研究尚局限于检测三嗪类除草剂等少数农药，如研ennan等人研制了用于检测阿特拉津的电化学免疫传感器，Yokoyama等人研制了用于检测阿特拉津等的压电晶体免疫传感器，Kroger等人研制了用于检测2，4-滴的电流免疫传感器，Minunni等人研制了用于检测阿特拉津的表面等离子体共振(surface plasmonresonance，SPR)免疫传感器等。

7、免疫芯片：免疫芯片(immuno chip)是指将抗原(或抗体)用适当方法固定在微小片基(如硅片等)上形成的抗原(或抗体)点阵阵列器件。阵列各点可以同时进行非均相(竞争或非竞争)标记型免疫反应，反应结束后洗涤去除游离物，用共聚焦荧光(荧光标记)显微扫描、电荷耦合元件(charged-coupled device，CCD)成像法进行检测。免疫芯片的研究与开发，为高通量免疫分析开辟了一个重要途径。

三、农药免疫分析技术的建立与应用

建立农药免疫分析技术的基本程序包括半抗原和抗原的合成、抗体的制备与分离纯化、半抗原或抗体的标记、免疫分析技术的建立和条件优化等。

(一)半抗原的合成

农药半抗原通常是指能耦联在分子质量大的载体(通常为蛋白质)上作为抗原决定簇、并具有反应原性的农药及其衍生物。农药半抗原必须具备3个基本要素，一是农药半抗原的自身结构应有一定的复杂性，能够被免疫活性细胞所识别；二是保持目标分析农药的分子结构(包括立体结构)特征；三是分子中具有可与载体蛋白质结合的活性基团(如羧基、氨基、羟基等)。有些农药分子中含有可与载体蛋白质耦联的活性基团，如苯氧羧酸类农药2，4-滴、2，4-滴丁酸。有些农药需要经过化学反应，产生活性基团，如硝基可还原成氨基、氰基可水解成羧基、卤素被碱解为羟基等。为了使目标分析农药的特征结构能够突出于载体蛋白质表面，成为有效抗原决定簇，通常在目标分析农药分子的非特异性部位衍生一个含2～6碳原子并具有末端活性基团的链状“连接臂”。研究发现，制备包被原的农药半抗原与制备免疫原的农药半抗原的“连接臂”有一定差别，有利于提高分析的灵敏度。

合成具有“连接臂”的农药半抗原一般从下述3个方面着手。

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相关链接：乙酰胆碱酯酶，电导率，三嗪类，苯氧羧酸