近年来，食品安全问题日益受到关注，已成为一个重要的公共卫生问题。金黄色葡萄球菌，是一类球形、直径约0.8μm、显微镜下呈葡萄串状排列的革兰氏阳性食源性病原体。S.aureus易引起乳制品、肉类、蛋类、冰淇淋等食品腐败污染，导致人类食物中毒。在许多国家，病原菌食物中毒事件中，S.aureus列居第二或第三位。其引起食物中毒的主要特征是：发病迅速，通常伴有恶心、呕吐、腹痛和腹泻等症状，严重时会引发败血症、脑膜炎和中毒性毒素休克综合征等疾病，对于婴幼儿、老年人、术后患者或其他体质较虚弱的人来说，S.aureus感染具有更大的威胁圈。当前，防止食品污染、延长保质期最简单有效的方法是使用天然或化学防腐剂。盐、糖、醋和酒精是传统的防腐剂，但一些细菌和霉菌可以耐受这些传统的防腐剂。相比之下，人工合成的化学防腐剂，如苯甲酸/苯甲酸钠、山梨酸/山梨酸钾、硝酸盐等，可有效抑制细菌生长，然而长期摄入这些化学防腐剂可能造成毒性累积，引起过敏、头痛等症状，还可能产生细菌耐药性。此外，一些化学防腐剂对食品感官品质也有一定影响。如今，植物源天然产物凭借不同抑菌机制发挥独特抑菌性能，其潜在功效和较少的副作用受到广泛关注。

工业大麻俗称火麻、汉麻，为大麻科、大麻属的一年生草本植物，是经遗传改良和人工选育的无毒新品种。其四氢大麻酚(△9-THC)的质量分数低于0.3％。多项研究表明，大麻对人体健康有益，可预防便秘、降低胆固醇、调节免疫、抗衰老、改善记忆。我国大麻资源丰富，在云南、广西、黑龙江、吉林等地都有野生或人工栽培的大麻分布。近年来，医用大麻二酚在癌症治疗方面的作用日益被重视，全球工业大麻种植、生产也不断合法化，工业大麻产业链已从农业、纺织业延伸到新材料、食品、生物医药等多个行业。工业大麻的种植面积逐渐增大。随之产生了较多工业大麻叶副产物，但其利用程度有限。

多项研究证实工业大麻叶能有效抑制S.aureus生长。隽惠玲等研究发现，工业大麻叶对S.aureus的最低抑菌浓度(MIC)为7.53mg/L；郭孟璧证实工业大麻雌株花叶多糖对S.aureus的MIC为3.125mg/L；张旭等采用超临界C0₂萃取工业大麻中的大麻二酚(CBD)、六氢大麻酚(CBN)和四氢大麻酚(△9-THC)，这3种大麻酚的混合物对S.aureus的MIC为6mg/mL；Giovanni等研究了工业大麻叶中5种大麻素对多种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)抑菌活性的影响，发现大麻素的异戊二烯基主要参与脂类亲和作用的调节，对抑菌作用影响较小，酚羟基的甲基化、乙酰化、前大麻素羧基的酯化以及第二个萜的引入都不利于抑菌活性，但其机制尚不明确。本课题组前期研究表明，来自大庆地区的工业大麻叶乙酸乙酯萃取物对S.aureus的MIC为7.81mg/L，且经紫外辐射、添加蔗糖和不同温度处理仍表现出良好的稳定性。目前，工业大麻叶对S.aureus抑菌的研究大多围绕抑菌效果开展。而关于抑菌组成和抑菌机制的研究鲜有报道。本实验在前期研究基础上。对工业大麻叶萃取物进行硅胶柱分离，评价了按不同比例的石油醚与乙酸乙酯洗脱后，萃取物各馏分对S.aureus的抑菌活性,利用GC-MS确定高活性馏分的化合物组成,进一步分析工业大麻叶对S.aureus的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

工业大麻叶：经鉴定为火麻1号品种，于2019年7月中旬采自黑龙江省科学院大庆分院东风农场试验田；金黄色葡萄球菌标准菌株[ATCC25923]：上海鲁微科技有限公司产品；硅胶粉：青岛海洋生物有限公司产品：氨苄青霉素钠：德国Ruibio公司产品；AKP试剂盒、可溶性蛋白质含量测定试剂盒、ATP含量试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司产品；SOD试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司产品；戊二醛固定液：福州phygene生物科技公司产品；无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、叔丁醇(AR)：均为辽宁泉瑞试剂有限公司产品。

7890B-7000c气相色谱质谱联用仪：安捷伦公司产品；Epoch多功能酶标仪：美国BioTek公司产品；UV-759紫外可见分光光度计：上海高致精密仪器有限公司产品；JSM7200F扫描电子显微镜：日本电子公司产品；DDS307电导率仪：上海红益仪器仪表有限公司产品：VFD-4500型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司产品：RE-201D型旋转蒸发仪：上海互佳仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工业大麻叶提取物制备

据张正海等的方法，取1.5kg阴干工业大麻叶，粉碎并过60目筛，以料液质量体积比为1g:15mL的比例加入体积分数为88％的乙醇，超声辅助提取20min，真空抽滤，重复3次，合并滤液，于40℃旋蒸至膏状(182g)。乙酸乙酯萃取，减压浓缩后得浸膏57g，用85.5g硅胶(100。200目)拌样后干法上样，经200。300目硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(体积比分别为1:0，50:1，20:1，5:1，1:1，0:1)，根据薄层色谱(TLC)合并相似馏分，共得到Frl-Fr6共6个馏分，旋蒸后调整质量浓度至10mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤除菌后，4℃保存，用于抑菌试验。

1.2.2 菌悬液制备

在无菌的条件下，将活化好的S.aureus单菌落接种于已灭菌的MH培养基，于37℃恒温培养16h，室温4000r/min离心后收集菌体，用无菌生理盐水稀释菌悬液至单位体积的菌落数为106~107CFU/mL，现用现配。

1.2.3 最低抑制浓度(MIC)测定

参考Tang等和Zhou等的方法并适当修改，采用微量2倍稀释法，向96孔板中加入90μL/孔菌悬液和10μL，孔的工业大麻叶提取物.使其质量浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、16、8μL，并设空白对照(不含细菌)和阳性对照(含等质量浓度的氨苄青霉素钠)，37℃恒温培养24h，肉眼直接观察，不出现浑浊的最小质量浓度即为MIC。

1.2.4 GC-MS化学成分分析

利用Frl-Fr6筛选S.aureus的活性后，取活性最佳的馏分并分析其组成。用甲醇稀释Fr5至质量浓度为1mg/mL，经0.22μm微孔滤膜过滤后进行GC-MS。GC：HP-5MS(30m×250μm，0.25μm)，He气流量为：1.1mL/min：升温程序为：100℃保持1min，以10℃/min速率升温到280℃保持12min：MS：四级杆温度：150℃，离子源(EI)：70eV，240℃，质量扫描范围：m/z50.0～500.0。

1.2.5 生长曲线绘制

参考Liu等的方法，按体积分数1％的接种量将S.aureus分别接种于含0MIC、0.5MIC、1MIC的工业大麻叶提取物的培养基中，37℃、120r/min振荡培养24h，酶标仪每隔2h测定OD_600nm，绘制0D_600nm-时间生长曲线。

1.2.6 菌悬液中AKP活力、可溶性蛋白质质量浓度圈、核酸相对浓度和电导率的测定

刎分别向含有0MIC、0.5MIC、1MIC的工业大麻叶提取物的培养基中加入菌悬液。使得菌悬液单位体积菌落数为106CFU，mL，于37℃，振荡培养，每隔2h取5mL菌液，4℃、4000r/min离心取上清液，按照各自试剂盒说明书的方法测定AKP活力和可溶性蛋白质质量浓度、紫外分光光度计测定260nm波长下吸光值、去离子水稀释20倍后电导率仪测定各时间点电导率。

1.2.7 胞内ATP浓度、SOD活性测定

分别于0、2、4、6、8、10h取1mL菌液，4℃、4000r/min离心后，弃上清液，按各自试剂盒说明书方法测定菌体ATP浓度和SOD活性。

1.2.8 扫描电子显微镜(SEM)观察及样品制

备按Zhou等的方法并稍加改动，将对数生长期S.aureus菌悬液单位体积的菌落数调整为107CFu/mL，加入工业大麻叶提取液使质量浓度分别为0MIC、1MIC,于37℃，120r/min振荡培养10h。取800μL菌体于室温下、4000r，min离心后弃上清液，用0.1mo‰L、pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤3次，离心收集菌体后用体积分数为2.5％的戊二醛溶液固定过夜。依次用体积分数为30.0％、50.0％、70.0％、80.0％、90.0％、100.0％的乙醇梯度脱水，叔丁醇置换。取细菌-叔丁醇悬浮液10μL滴于10mm×10mm硅片上，用真空冷冻干燥机干燥，喷金后SEM观察。

1.2.9 数据处理

试验重复3次，结果采用DPS7.05软件对数据进行Duncan多重比较分析，GraphPadPrism7软件绘图。

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