细胞壁缺失对副溶血性弧菌生物学特性的影响（二）

发布时间：2021-10-17 09:10 编辑者：特邀作者周世红

2 结果与分析

2.1 细胞壁缺失对副溶血性弧菌最小抑菌浓度的影响

在确定肉桂醇对副溶血性弧菌有抑菌活性基础之上，采用二倍稀释法测定3组副溶血性弧菌(包括UG、OMDG、CWDG)的MIC，结果见表1，细胞壁缺失可以改变副溶血性弧菌对抑菌剂的敏感性。肉桂醇对UG、OMDG和CWDG的MIC分别为原液质量浓度的1/32、1/256和1/256。由该结果可知，丢失外膜层使菌体对肉桂醇的敏感程度增加，而进一步丢失肽聚糖层未改变菌体对肉桂醇的敏感程度，说明外膜是肉桂醇抑制副溶血性弧菌的主要作用位点。彭志峰等曾对比土霉素和四环素对鸭源鸡杆菌亲本株RU和外膜孔蛋白OmpW突变株△Omp形的MIC，结果显示，△0mp形的MIC值分别降低到RU的1/8和1/32，与本试验结果一致。以上结果说明，外膜孔蛋白是外膜层中抑菌剂作用的靶点。

2.2 细胞壁缺失对副溶血性弧菌细胞膜完整性的影响

核酸和蛋白质均是菌体重要的单位结构物质，在核酸和蛋白质的特征吸收波长处菌液吸光度值增大时，说明二者发生了外渗，表明细胞膜完整性遭受破坏。从表2中可以看出，通过不同质量浓度的肉桂醇处理后，3组副溶血性弧菌的细胞膜均受到不同程度的破坏，并且随着肉桂醇质量浓度的增加，受到的破坏也越大，说明肉桂醇会作用于细菌细胞膜。当肉桂醇质量浓度低至1/4MIC时。对3组副溶血性弧菌的抑制作用已经减弱，与空白组的细胞膜受损程度相近。相较于UG，OMDG和CWDG菌液中特征性吸光度值无显著差异(P＜0.05)，表明进一步的去除肽聚糖层对细胞膜的完整性无影响，即细胞壁中外膜层是菌体抵抗抑菌剂的主要结构，对细胞膜的损伤有保护作用。

2.3 内膜通透性对肉桂醇抑菌性能的影响

硫酸粘杆菌素是一种窄谱抗生素，对革兰氏阴性菌有很强的抑菌作用。它先与外膜层中的脂多糖结合，破坏外膜通透性，进而与细胞膜上脂蛋白结合，使细胞膜的通透性增加、表面张力降低，导致胞内的重要物质外渗，严重时引起菌体死亡例。由表3可知，在UG中，肉桂醇质量浓度越低，菌体受到的破坏越小，内容物渗出越少，0D值就越小；在0MDG和CWDG中,由于外膜层已被去除，细胞膜被硫酸粘杆菌素破坏，导致加入的肉桂醇已经没有可以作用的部位，因此肉桂醇质量浓度的变化对结果无影响，故肉桂醇可能对外膜和细胞膜都有作用。

2.4 外膜蛋白SDS-PAGE

将从试验菌株副溶血性弧菌ATCCl7802中提取的外膜蛋白进行SDS-PAGE试验，结果见图2。共获得10条蛋白条带，其分子质量大小在18.4～66.2ku之间。与之前文献报道的副溶血性弧菌外膜蛋白分子量范围相符。

2.5 外膜蛋白竞争试验

竞争试验主要是用来判断肉桂醇的作用位点是否为外膜层中的外膜蛋白。由图1计算m提取的外膜蛋白样品的质量浓度为512μg/mL，满足竞争试验中对外膜蛋白的浓度要求。将副溶血性弧菌的外膜蛋白与1/2MIC肉桂醇互混1h后再与菌体细胞共培养.外膜蛋白以剂量依赖方式减小肉桂醇对菌体细胞的损伤作用(图3)，这说明肉桂醇能与外膜蛋白产生相互作用，故菌体无法被PI染色，凋亡图中总凋亡率随外膜蛋白质量浓度的增大而降低。

2.6 细胞壁缺失对副溶血性弧菌药物敏感性的影响

细胞壁缺失对副溶血性弧菌药物敏感性的影响见表4。抗生素在抑菌过程中作用的靶点不尽相同，四环素和红霉素能抑制蛋白质的合成，万古霉素能抑制细胞壁的合成，环丙沙星能抑制DNA的合成和复制，利福平能抑制RNA的合成。所测抗生素对UG均有效，作用于细胞壁的万古霉素对0MDG和CWDG无效，说明处理的菌体缺失了其作用靶点。然而，利福平在接触0MDG细胞时药效下降，这可能是因为外膜尤其是外膜蛋白是利福平进入菌体的通道，而在接触CWDG细胞时药效丢失，可能肽聚糖层也在该药进入细胞过程中起到一定作用，具体机制有待进一步研究。