苦荞麦俗称苦荞，学名鞑靼荞麦(Fagopyrumtataricum)，是一年生或多年生宿根植物，起源于中国西南部，生长范围遍布亚洲、欧洲和北美洲。苦荞麦属于药食两用作物，富含碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素及各种矿质营养元素，具有极高的营养价值；同时与其他粮食作物相比，其富含黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抑菌、降血糖、抗肿瘤等生理功能。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌是常见的引起食物中毒的食源性致病菌，粪肠球菌是人畜共患病原菌且耐药性严重：志贺氏菌是细菌性痢疾最为常见的病原菌，藤黄微球菌会引起脑膜炎、肺炎等。随着抗生素在人类和动物疾病治疗及农业生产中的大量使用，耐药性问题日益严重，天然植物源抑菌剂以其天然、安全、高效等特性已成为研究热点。已有研究表明，黄酮类化合物对许多病原微生物具有广谱抑菌特性，鉴于其不易产生耐药性的优势，深入研究含有黄酮类的天然植物源活性成分对于天然抑菌剂及抗菌药物的研发具有至关重要的作用。有研究表明苦荞麸皮中含有大量黄酮类化合物，其黄酮含量约为苦荞粉的5倍，但由于其口感粗糙、食味苦涩且不易消化，所以在苦荞制品加工过程中多被丢弃，加工利用率低。

目前，对苦荞麸皮黄酮类化合物的研究多涉及苦荞麸皮黄酮提取工艺的优化及苦荞麸皮黄酮含量的检测，对苦荞麸皮黄酮类的抗菌活性研究较少。为探究苦荞麸皮黄酮类化合物对常见病原菌的抗菌活性，提高苦荞麸皮资源的利用效率，作者选取了大肠杆菌、志贺氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、肠球菌等6株病原菌作为供试菌，采用平板打孔法及二倍稀释法检测苦荞麸皮黄酮粗品和精品的抗菌性能，通过高效液相色谱法分析粗品与精品黄酮类化合物的成分及含量区别，并在测定黄酮单体抗菌活性的基础上，讨论了其主要成分的构效关系，以期为苦荞麸皮的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦荞麸皮原料：四川环太生物科技股份有限公司产品；芦丁标准品、山奈酚标准品(纯度均≥98％)：上海麦克林生化科技有限公司产品；山奈酚-3-0-芸香糖苷标准品、异槲皮苷标准品(纯度均≥98％)：成都普思生物科技股份有限公司产品；槲皮素标准品(纯度≥98％)：Sigma公司产品；LB肉汤培养基、LB琼脂培养基：青岛高科技工业园海博生物科技有限公司产品；琼脂：Biofroxx公司产品。

供试菌种：金黄色葡萄球菌(StaphylOCOCUSaureus，ATCC25922)：藤黄微球菌(Micrococcusluteus.CMCC28001)：耐久肠球菌(Enterococcusdurans)：大肠杆菌(Escherichiacoli，ATCC25922)；志贺氏菌(Shigellacastellani)；肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis，CVCC3377)。上述指示菌株均为作者所在实验室保藏菌种。

HZK-FA210型电子天平：福州华志科学仪器有限公司产品：SL502N型分析天平：上海民桥精密仪器科技有限公司产品：YLD-2000型电热恒温鼓风干燥箱：上海琅开实验设备有限公司产品：YRE-301旋转蒸发器：巩义市予华仪器有限责任公司产品：净品级ADS-7型大孔吸附树脂：天津浩聚树脂科技有限公司产品；LC-16型高效液相色谱仪：日本岛津公司产品；PS-06A型超声波清洗机：东莞市洁康超声波设备有限公司产品；UV-2600型紫外可见分光光度计：日本岛津公司产品：LDZX-30KB型立式蒸汽压力灭菌锅：上海申安医疗器械厂产品：1389型生物安全柜：美国Thermo公司产品：SKY-211C型恒温摇床：美谷分子仪器有限公司产品；DZKW-D-4恒温水浴锅：上海苏坤实业有限公司产品；HPS一250型恒温培养箱：哈尔滨市东明医疗器械厂产品。

1.2 实验方法

1.2.1 苦荞麸皮总黄酮制备方

取苦荞麸皮适量，参照文献提取工艺条件：料液质量体积比1g:10mL，乙醇体积分数70％，提取温度60℃热回流提取3h，重复提取3次，合并提取液并减压浓缩至干，即得苦荞麸皮黄酮粗品。以苦养麸皮黄酮粗品加适量水样品制成上样液，通过ADS-7型大孔吸附树脂进行动态吸附，用体积分数90％乙醇作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液减压浓缩至干，即得苦荞麸皮黄酮精品。

1.2.2 抑菌活性测定

（1）总黄酮样品的制备

用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，称取苦荞麸皮黄酮粗品及精品各5g，加入5mLDMSO，超声辅助溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤，配成质量浓度1g/mL药液。

（2）制备指示菌平板

将供试细菌接种于LB琼脂培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养18～24h。取对数生长期的供试细菌，接种于LB液体培养基中，37℃、150r/min条件下培养过夜。取活化好的供试菌种，用无菌生理盐水调整菌液澄清度，将菌液浓度调至0.5麦氏单位，约1×108CFU/mL。参照谭才邓等的方法，使用预加菌液倾注平板法制备试验平板。向20mL冷却至50℃左右的LB固体培养基中接种1mL菌悬液，混合均匀后倒入无菌培养皿中，水平静置。

（3）打孔法测定抑菌活性

通过平板打孔法测定抑菌圈直径。待指示菌平板冷却凝固后，用外径为8mm的打孔器打孔(孔间距不少于25mm，孔中心距平皿边缘不少于15mm)。用无菌针头小心挑去培养基小块，孔中滴加少量体积分数0.5％琼脂封底。向各孔中分别加入苦荞麸皮黄酮粗品(质量浓度1μL)、苦荞麸皮黄酮精品(质量浓度1μL)、DMSO各80μL，对应做好标记，置于37℃的培养箱中培养24h。采用十字交叉法测定抑菌圈直径，每组实验重复3次。

1.2.3 最低抑茵浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定

（1）样品的制备

将苦荞麸皮黄酮精品及粗品用DMSO溶液配制成质量浓度200mg/mL的溶液，0.22μm微孔滤膜过滤，用液体培养基依次倍比稀释成质量浓度100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56mg/mL；4种黄酮单体分别用DMSO溶液配制成质量浓度50mg/mL的溶液，0.22μm微孔滤膜过滤，用液体培养基依次倍比稀释成质量浓度25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39mg/mL。

（2）菌悬液制备

将供试细菌接种于LB琼脂培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养18～24h。取对数生长期的供试细菌，接种于LB液体培养基中，37℃、150r/min条件下培养过夜。取活化好的供试菌种，用无菌生理盐水调整菌液澄清度，将菌液浓度调至0.5麦氏单位，约l×l0⁸CFU/mL。

（3）MIC及MBC测定

采用二倍稀释法进行最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定。分别吸取100μL母液及梯度稀释样品于96孔板的2-9孔内。每个孔中分别加入100μL稀释至l×l0⁸CFU/mL的菌悬液。第10孔；OH200μL液体培养基作为阴性空A对照，第11孔加100μL菌液和100μL液体培养基为阳性空A对照。将96孔板置于培养箱中37℃培养24h后，通过肉眼比对发现微孔内液体澄清透明经震荡后仍无沉淀产生，则此微孔对应的药液浓度即为此样品对供试细菌的最低抑菌浓度(MIC)。将无细菌生长的微孔中液体吹打混匀后取100μL涂布于无菌培养基平板，于37℃继续培养24h，仍无菌落生长的最低药物浓度为样品的最小杀菌浓度(MBC)。

1.2.4 高效液相色谱法测定

（1）标准品溶液制备

称取芦丁、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚标品粉末适量于EP管中，甲醇充分溶解，再各管吸取适量标准品溶液进行混合，0.22μm微孔滤膜过滤。

（2）样品溶液制备

精密称取苦荞麸皮黄酮粗品及精品10mg，10mL甲醇充分溶解，0.22μm微孔滤膜过滤。

（3）色谱条件

参照文献方法进行改进。IntersustainC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.2％磷酸(B)，梯度洗脱(0～25min，15％～25％A；25～35min，25％～50％A；35～45min，50％～90％A；45～55min，90％A)；体积流量1.0mL/min：柱温35℃；检测波长360nm；进样量20μL。检测后与混合标准品进行对比。

1.2.5 数据处理

实验数据均为3次重复实验的均值，数据用SPSS24.0软件进行统计分析，计算其均值与标准差。

相关链接：金黄色葡萄球菌，槲皮素，山奈酚，异槲皮苷

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