银杏作为银杏科植物唯一幸存树种，有活化石之称，其果、叶、根、花粉等均可入药，其中银杏叶的提取物有很高的生物活性和较好的药用价值，可用作草本膳食补充剂和植物药物。银杏叶提取物作用主要集中在抗氧化、抗癌、缓解压力、改善认知功能（记忆力和注意力）和血液循环，预防并治疗耳鸣、酒精性肝损伤、糖尿病、神经退行性疾病等。银杏叶提取物中的生物活性主要归功于黄酮类和萜类化合物，故黄酮化合物和萜类化合物的含量指标是判断银杏叶提取物质量的标准。

银杏叶及其提取物中黄酮含量检测方法主要有分光光度法、近红外法、荧光光度法、液相色谱法、液质联用等，其中液相色谱法具有仪器价格较低、操作简单、准确性高、检出限低等优点，在实际中应用较多。多数HPLC法测银杏中黄酮含量时，先水解样品，使其中的化合态黄酮转变为游离态黄酮，以测出化合态和游离态之和一总黄酮含量，来判定其总黄酮质量。有很多不法商贩利用这一特性，在银杏叶及其提取物中添加其他含槲皮素、山柰酚等较高的物质，以达到相关标准中关于银杏叶提取物黄酮含量指标要求，以次充好，对银杏叶提取物的质量判断产生了一定的干扰，因此需要建立一种测定银杏叶及其提取物中游离黄酮含量的方法。目前关于游离黄酮的研究多数集中在液质联用等较贵重仪器，HPLC法研究较少，如蒲擎宇等以甲醇为提取溶剂，检测银杏中槲皮素、山奈酚、异鼠李素3种游离黄酮含量，但该方法耗时长，加热回流需6h，溶剂消耗大。

本文旨在建立可同测定银杏叶及提取物中芦丁、槲皮素、山柰酚、异鼠李素4种游离黄酮含量的方法，力求缩短检测时间，降低能耗。同时评价市面上银杏叶提取物中游离黄酮含量水平，分析原料及提取物之间对应各游离黄酮含量关系，以期更好为企业生产提供技术支持和服务。

一、材料与方法

1、材料与仪器

芦丁、槲皮素、山柰酚、异鼠李素标准品，均购于sigma公司，纯度分别为96.6％、99.5％、97.0％、95.0％；磷酸、甲醇、乙醇、超纯水，其中甲醇为色谱纯，其余均为分析纯；银杏叶3批、银杏叶提取物3批。Waterse2695液相（配备紫外检测器）；恒温水浴锅（配备冷凝回流系统）；超声清洗器。

2、试验方法

（1）标准溶液的配制

分别称取芦丁、槲皮素、山柰酚、异鼠李素标准品6.06mg、4.67mg、6.00mg、1.07mg于50mL容量瓶中，用甲醇超声溶解后定容，即得0.1212mg/mL芦丁、0.0934mg/mL槲皮素、0.1200mg/mL山柰酚、0.0214mg/mL异鼠李素混合标准溶液。

（2）银杏供试样品液的制备

银杏叶：银杏叶原料粉碎过筛混匀后，称取5g样品，100mL甲醇萃取后补重，混匀，过0.459m有机系滤膜，待测。

银杏叶提取物：称0.5g提取物于50rIlL容量瓶中，加入少量甲醇超声溶解，冷却至室温，甲醇定容，混匀，过0.459m有机系滤膜，待测。

(3）4种游离黄酮含量的计算

C_样=S_样×C_标×V×100/（S_标×m_样×1000）式中：C_样为样品中某一成分游离黄酮含量，％；S_样为样品中对应游离黄酮峰面积；S_标为对应标样峰面积；m_样为样品称样量，g；V为样品液定容体积。

二、结果与分析

1、色谱条件的优化

通过优化进样量（3μL、5μL和10μL）和洗脱程序（等度和梯度），确定优化后色谱条件为：

色谱柱：AgilentEclipsePlusC18（4.6mm×100mm，3.5μm）柱温：40⁰C；

进样量：5μL；

流动相：A：0.4％磷酸水溶液，B：甲醇，梯度洗脱程序见表1。

优化后的色谱条件下银杏叶提取物的液相图谱如图1所示。

2、银杏叶前处理条件优化0.2在其他条件一定的情况下，单因素实验验证萃取方式、萃取时间、萃取温度、回流时间对萃取效果的影响。

（1）萃取方式的选择

称取5g原料，加入100mL甲醇，采用超声萃取和加热回流萃取，比较超声和回流两种方式萃取效果，结果如图2所示。由图2可知，在萃取时间分别为30min、60min、90min时，加热回流萃取银杏叶总游离黄酮含量均高于超声回流方式，故银杏叶萃取方式选为加热回流。

（2）萃取时间的选择

称取5g原料，加入100mL甲醇，80℃加热回流萃取银杏原料选取原料，萃取时间分别为0min、5min、10min、20min、30min、60min、90min，对比结果如图3所示。

由图3可知，回流萃取30min时游离黄酮的结果已趋于稳定，延长萃取时间检测结果无明显变化，故萃取时间选为30min。

通过单因素实验验证，优化后银杏叶中游离黄酮前处理条件为甲醇800C加热回流30min。

3、标准曲线和线性范围

对混合标准溶液做2倍梯度浓度稀释，所得芦丁、槲皮素、山柰酚、异鼠李素线性方程、相关系数、线性方程见表2。

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