转谷氨酰胺酶催化的糖基化修饰对黑豆蛋白抗氧化活性的影响（一）

黑豆因其种皮呈黑色而得名，营养丰富，具有高蛋白、低热量的特性，其含有微量元素、维生素和大豆皂甙等多种功能因子，此外，黑豆还具有美容、防癌作用；壳寡糖是一种聚合度在2～20之间的寡糖，具有分子量低、吸附效果好，水溶性好、易被人体吸收、生物活性高，调节肠道微生态、改善肠道组织形态和增强免疫功能等特点；蛋白质的糖基化修饰，是以共价键连接的方式将亲水性的糖类物质导入蛋白质分子之中，使其既有蛋白质的分子特性，又有糖类物质的亲水特性；研究表明，蛋白质糖基化修饰后表现出优越的乳化能力，其溶解性、胶凝性、流变学特性、抗氧化性、热稳定性、抗菌性等功能特性也有所提高。蛋白质糖基化修饰后抗氧化性的研究较少；本文利用糖基化修饰技术，以壳寡糖和黑豆蛋白为研究对象，制备壳寡糖糖基化黑豆蛋白，探讨其抗氧化性能的变化，为拓展糖基化蛋白改性和提供天然的抗氧化剂提供基本技术依据。

一、材料与方法

1、材料和试剂

黑豆，黑龙江地产青仁黑豆。DPPH(分析纯)，美国Sigam公司；ABTS(AR级)，美国Sigam公司；水溶性维生素E(Trolox)，美国Sigam公司；壳寡糖，浙江金壳药业有限公司；三氯化铁(FeCl₃)(分析纯)，天津金汇太亚化学试剂有限公司；铁氰化钾(K₃Fe(CN)₄)(分析纯)，天津光复精细化工研究院；三氯乙酸(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂，磷酸三钠(Na₃PO₄)(分析纯)，天津市长鑫宏翔商贸有限公司；钼酸铵(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；亚硝酸钠(分析纯)，天津市鸿鑫化学试剂有限公司；对氨基苯磺酰胺(分析纯)，天津光复精细化工研究院；盐酸N-(1-萘基)-乙二胺(分析纯)，天津光复精细化工研究院。

2、试验仪器

DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅购白天津市泰斯特仪器有限公司；紫外可见分光光度计购自瓦里安科技有限公司；XS204电子分析天平购自上海精学科学有限公司；漩涡混合器购自江苏同君仪器科技有限公司。

3、方法

（1）溶液配制

①DPPH工作液配置：精确称量0.0123gDPPH，乙醇充分溶解并定容至50mL，作为DPPH工作液(0.39mM)。

②PBS缓冲液：称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HP0₄和0.24gKH₂P0₄，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH至7.4，最后加蒸馏水定容至lL即可。高压蒸汽灭菌20min，保存于室温或4℃冰箱中。

③ABTS工作液配置：精确称取0.192lgABTS标准品溶解于50mL蒸馏水中，制成7.0mol／L的ABTS水溶液。精确称取0.3312g过硫酸钾溶解于500mL蒸馏水中，制成2.45mmo/L过硫酸钾水溶液。将50mLABTS水溶液与50mL过硫酸钾水溶液混合，在室温下避光放置12h～16h，形成ABTS自由基储备液。准确吸取1.0mL加入40～50mL的无水乙醇，在734nm下吸光度为O.700±0.020得到ABTS工作液。

(2)黑豆蛋白的制备

①黑豆分离蛋白：黑豆蛋白分离提取的方法参照本研究前期试验中经过优化的提取方案：400g黑豆豆粕粉，加水4L，用0.5mol／LNaoH调pH至8.5，50℃水浴搅拌1.5h，8000r/min离心10min取上清液，用0.5mol／L盐酸调pH至4.5，8000r/min离心10min取下层固体，用pH为4.5的蒸馏水洗两遍，8000r/min离心10min，取沉淀，用0.5mol／LNaOH调pH至7.0，冷冻干燥(干燥条件：干燥架温度-20℃，真空度0.5mbar)

②酶法糖基化黑豆蛋白：酶法糖基化黑豆蛋白的方法参照本实验前期试验中优化所得方案：取1.5g黑豆分离蛋白，加1.5g壳寡糖，1.0g转谷氨酰胺酶和100mL蒸馏水，37℃水平振荡反应4h，80℃水浴灭酶5min，冷却至室温后4℃透析除去未结合的壳寡糖，冷冻干燥。

③自交联黑豆蛋白：为对比不同改性方法下黑豆蛋白的抗氧化性，转谷氨酰胺酶的加入比例同②，取1.5g黑豆分离蛋白，加1.0g转谷氨酰胺酶和100mL蒸馏水，37℃水平振荡反应4h，80℃水浴灭酶5min，冷却至室温后4℃透析除去未结合的壳寡糖，冷冻干燥。

④湿热法糖基化黑豆蛋白：为对比不同改性方法下黑豆蛋白的抗氧化性，壳寡糖的加入比例同②，取1.5g黑豆分离蛋白，加1.5g壳寡糖和100mL蒸馏水，90℃水浴4h，取出在25℃水浴5min，4℃透析除去未结合的壳寡糖，冷冻干燥。

(3)DPPH自由基清除能力测定

本试验中DPPH自由基清除能力测定在参考Sajga等的方法基础上，稍作改动。吸取1mL待测液，加入2mLDPPH工作液充分摇匀，在室温下避光30min，在517m处测定该液吸光度(Ai)，以无水乙醇作为空白，同时测定lmL试液与2mL无水乙醇的吸光度(Aj)及1mL无水乙醇和2mLDPPH工作液混合液的吸光度(Ac)，按下式计算DPPH的清除率(SA)。

（4）ABTS自由清除能力测定

参照唐艳平等的方法略作改动。吸取1.0mL待测液加入1.0mL的ABTS工作液，混匀。在室温下避光10min，于波长734nm下测其吸光度(Ai)，无水乙醇作为空白，同时测定30μL试液和1.0mL无水乙醇混合液吸光度(Aj)及30μL无水乙醇和1.0mL的ABTS工作液混合液吸光度(Ac)，按下式计算ABTS自由基清除率(SA)。

（5）总还原能力的测定

本试验中样品总还原能力的测定在Oyaizu等的方法基础上稍作调整。取测试样品溶液0.5mL加入pH为6.6的磷酸盐缓冲溶液和1％的K₃Fe(CN)₆溶液各2.5mL并混合均匀，于50℃放置20min，加入2.5mL蒸馏水和1.0mL0.1％的FeCl₃混合均匀，静止10min后于700nm下测定吸光度(用0.5mL的蒸馏水替换0.5mL样品溶液其他条件不变作为调零溶液)。

（6）总抗氧化能力的测定

本试验中总抗氧化能力的测定参照Benzuie和Strain的方法，略做改进。使用磷钼络合物法，又称钼蓝法。总抗氧化能力测定原理：钼酸铵会在硫酸与磷酸的作用下发生还原反应，产物呈现绿色，该物质在695nm处有最大吸收波长。抗氧化剂会和钼会竞争发生还原反应，从而影响绿色产物的生成量。可以通过分光光度法通过测定吸光度来检测钼蓝的产量，以此间接的反映出抗氧化剂的能力。吸光度值越高表明抗氧化剂的抗氧化能力越强。在具塞试管中依次加入1.0mL(3mol／L)H₂S0₄溶液，1.0mL(0.14mol／L)Na₃P0₄溶液和1.0mL(0.2mol／L)钼酸铵溶液，再分别加入1.0mol以上样品溶液，蒸馏水定容至5.0mL摇匀，加塞于95℃水溶液中加热90min，取出冷却至室温后在695nm波长下测定吸光度。

（7）清除亚酸盐能力的测定

本试验中亚硝酸盐清除能力的测定根据李佳颖等的方法，略作修改。准确吸取0.5mL样品溶液于试管中，分别加入5μg，mL亚硝酸钠溶液250μL，振荡均匀，加pH3.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液2.0mL，混匀后于37℃水浴30min。加入1mL浓度为0.4％对氨基苯磺酰胺和1mL浓度为0.2％盐酸N-(1-萘基)-乙二胺，混匀并定容至刻度，静置15min，于545nm波长测定其吸光度Ao。同用无水乙醇代替样品其他条件不变，测得吸光值为氏；lmL浓度为0.2％盐酸N-(1-萘基)-乙二胺换为1.0mL无水乙醇测定吸光值为A₂。按下式计算清除率(SA)。

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