响应面法优化辣椒油树脂提取工艺及其抗氧化和抑菌性研究（一）

发布时间：2021-03-10 12:54 编辑者：周世红

辣椒（CapsicumannuumL），原产于中拉丁美洲热带地区，在中国主要分布在四川、贵州、湖南、云南、河南等地。辣椒油树脂（Capsicumoleoresin）是通过从辣椒中提取和浓缩而获得的油状液体混合物，它除了含有主要成分辣椒碱类物质和辣椒红色素（Capsanthin）外，还含有少量的脂肪酸、蛋白、果胶、多糖等其他化学物质。

辣椒油树脂是重要的食品加工原料，同时也是提取辣椒红色素和辣椒碱的中间体，因具有抗氧化、抑菌和抗癌等生理活性，对于它的研究具有重要意义。KimJS等研究发现辣椒提取物因含有辣椒红素和β-胡萝卜素，对H2O2诱导间隙连接细胞间的通讯抑制有保护作用。这表明，其有助于降低氧化应激引起的疾病风险。目前工业上对于辣椒油树脂的提取主要有浸提法，即浸提干红辣椒粉末后的滤液再经减压浓缩后得到辣椒油树脂，但溶剂浸提法提取时间长，效率低。Melgar-Lalanne，G等研究超声辅助提取辣椒油树脂，发现超声提取不仅得率会有所提高，还会大幅缩短提取的时间，提高提取效率。本实验借助超声辅助有机溶剂提取辣椒油树脂，结合响应面分析方法对提取工艺进行优化。并对其体外抗氧化活性和抑菌活性进行探究，旨在对辣椒油树脂的提取和综合利用提供理论基础。

一、材料与方法

1、试验材料与试剂

干红辣椒（朝天椒），市售；95％乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯均为分析纯；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）（AR≥95％）、ABTS（2，2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）；测试菌种：金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）、大肠杆菌（escherichiacoli）、枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）；培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。

2、仪器与设备

WJX-800A型高速多功能粉碎机；AL204电子分析天平；HRHS24型电热恒温水浴锅；SP-2000UV型紫外可见分光光度计；SC-3614型低速离心机；101-2AB型电热鼓风干燥箱；SB-5200DT型超声波清洗器；YSQ-LS-50Ⅱ立式蒸汽灭菌锅。

3、提取试验

（1）辣椒油树脂提取工艺

干红辣椒经清洗后置于电热鼓风干燥箱中65℃烘干至恒重。烘干后的辣椒经过去蒂、除籽后进行粉碎、过筛（45目筛），将辣椒粉置于棕色瓶中备用。准确称取29辣椒粉末，按8:1mL／g的液料比加入相应体积溶剂，超声辅助提取30min后，经4000r／min离心10min后收集上清液，减压浓缩得辣椒油树脂。根据公式（1）计算辣椒油树脂得率。

（2）溶剂的选择

根据文献例选择丙酮、95％乙醇、乙酸乙酯、正己烷和乙醚5种机溶剂进行浸提。准确称取5份原料样品，分别加入相应体积的丙酮、95％乙醇、乙酸乙酯、正己烷和乙醚，按相应条件提取。辣椒油树脂提取液经过滤后，减压浓缩，考察不同提取溶剂对辣椒油树脂得率的影响。

（3）单因素试验

称取2g辣椒粉末，以辣椒油树脂得率为指标，考察不同液料比（6:1、7:1、8:1、9:1、10:1mL／g）、超声时间（15、20、25、30、35min）和超声温度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）对辣椒油树脂得率的影响。

（4）响应面试验设计

以单因素试验为依据，根据Box—Behnken试验设计原理，运用Design-ExpertV8.0.6软件程序，进行三因素三水平试验，确定提取辣椒油树脂最优工艺条件。试验因素及水平见表1。

4、体外抗氧化活性研究

（1）还原力的测定

配制不同浓度的辣椒油树脂样品溶液，以VC为参照，进行实验。量取2.5mL样品溶液，加入等体积磷酸缓冲盐溶液和1％的铁氰化钾溶液，水浴（50℃）反应20min后迅速冷却，加入2.5mL10％的CF3COOH溶液，取5mL反应液，加入4mL的蒸馏水和1mL的0.1％三氯化铁溶液，充分混匀，静置10min后于700nm处测定吸光值，以蒸馏水为空白，重复三次。以样品的吸光度表示辣椒油树脂的还原能力，吸光值越大，还原力越强。

（2）DPPH自由基清除能力测定

精确称取DPPH标准品0.0039g，用乙醇定溶至100mL。取2mL不同浓度的样品溶液于试管中，分别加入2mL的DPPH溶液，摇匀后，避光反应40min，在517nm处测得吸光值As；同法取2mL乙醇加入等体积DPPH溶液，测其吸光度为Ab，样品重复三次，取平均值。以VC为阳性对照，按公式（2）计算DPPH清除率。

（3）ABTS自由基清除能力测定

按1:1比例混合7mmol／L的ABTS和2.45mmol／L的K₂S₂O₈，黑暗中反应12h，产生ABTS⁺，使用前用乙醇稀释成备用的ABTS溶液（使其在734nm下吸光值为0.70+0.02）。吸取0.4mL不同浓度样品溶液和4.0mLABTS溶液，反应1min后，在734nm下测定吸光值As，用蒸馏水做空白对照Ab，以VC作阳性对照，每组试验重复3次，按公式（3）计算ABTS自由基清除率。

5、抑菌活性研究

（1）菌种的活化及菌悬液的制备

将于4℃冰箱保存的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，于37℃培养箱中培养24h。挑取活化好的菌种分别放入已盛有无菌生理盐水的试管中，摇匀，制成菌悬液，使菌悬液中细菌数为1～2×10⁷个。

（2）抑菌效力测定

采用琼脂打孔注入法。将高压蒸汽灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基趁热倒入已灭菌的培养皿中，待培养基冷凝后加入0.1mL菌悬液，涂布均匀。用灭过菌的金属打孔器（约6mm）在平板上打四个孔，并去除孔内琼脂。吸取不同浓度的辣椒油树脂溶液0.1mL注入孔内，以无菌生理盐水为空白对照。然后把培养皿放在恒温培养箱中37℃培养24h后，观察抑菌圈直径大小。

（3）最低抑菌质量浓度测定

通过二倍稀释法将辣椒油树脂提取物进行梯度稀释，制成0.156mg／mL、0.3125mg／mL、0.625mg／mL、1.25mg／mL、2.5mg／mL、5.0mg／mL、10.0mg／mL、20.0mg／mL浓度的样品提取液。向已灭菌的培养基平板中分别添加不同浓度样品稀释液各0.1mL，再分别添加各试验菌菌悬液0.1mL，均匀涂布培养24h，重复三次，观察结果。以不长菌的平板对应的样品最低浓度即为最小抑菌浓度，以无菌生理盐水为对照。