L-赖氨酸是人类和动物所必需八大氨基酸之一。在医疗方面应用非常广泛，比如防治骨质疏松症，提高机体的免疫功能和对传染病的抗病能力，又如赖谷复合盐用于治疗慢性脑组织缺血、颅脑外伤病及缺氧性疾病的脑保护，还可以用于治疗单纯疱疹病毒和带状疱疹引起的唇疱疹等。近年来，90%以上的L-赖氨酸产品用于饲料添加剂，各大生产企业相继扩能投产，行业竞争惨烈。如何提高赖氨酸发酵糖酸转化率、降低设备腐蚀，是降低生产成本提高企业竞争力的关键点。

甜菜碱作为发酵促进剂在氨基酸发酵中应用的研究很多，总结其主要功能包括两点：1)维持和调节细胞渗透压。当外界渗透压发生剧烈变化时，细胞吸收或合成的甜菜碱通过稳定蛋白质结构、提高钾钠泵功能和阻止胞内水分丢失等方式增加细胞对渗透压的抗性。黄登高等在研究乳酸发酵时发现，甜菜碱能够提高高糖浓度下乳酸菌的细胞生长速率和乳酸脱氢酶的活力，进而提高乳酸产量。2)参与甲基化反应。常立群等发现在谷氨酸发酵中添加适量甜菜碱可提高谷氨酸产酸。刘丽君在L-异亮氨酸产生菌的选育及发酵条件研究中介绍到，通过添加甜菜碱2.5g/L使得苏氨酸发酵周期缩短12h，L-异亮氨酸产量提高66.3%。赵琳琳在脱氮假单胞菌产VB12发酵过程中甜菜碱作用机理及其补料策略的研究中介绍了甜菜碱在发酵过程中作用机理，甲基参与合成甲硫氨酸、VB12和丙氨酸等多种物质，并指出甜菜碱分子中含有3个甲基，是高效的甲基供体，还得出甜菜碱质量浓度在2～3g/L时菌浓增加了10.5%，VB12产量增加了23.8%的结论。

磷酸甜菜碱是甜菜碱的磷酸盐，在赖氨酸发酵中应用研究较少。目前，大多数企业在赖氨酸发酵配方中添加一定量的氯化胆碱起到调节渗透压、提供甲基化反应的甲基的作用，但氯化胆碱中氯离子对设备腐蚀性严重。“中国饲料行业信息网”报道，市场上质量分数为21%的氯化胆碱价格逐年上涨，2016年均价5400元/吨，2017年涨至6319.5元/吨，2018年涨至15000元/吨，已经造成赖氨酸发酵成本上升10元/吨理论酸，而磷酸甜菜碱市场价格2016年为9600元/吨、2017年8952元/吨、2018年13500元/吨。相比之下磷酸甜菜碱价格上涨幅度较小。因此，笔者继续实验了磷酸甜菜碱替代氯化胆碱在赖氨酸发酵中的应用，可为提高赖氨酸发酵指标、降低生产成本提供方向。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

伊品生物科技股份有限公司菌种中心提供赖氨酸生产用菌。

1.1.2实验配方

三级种子基础配方：MnSO₄质量2kg，FeSO₄质量2kg，KH₂PO₄质量60kg，K₂HPO₄质量60kg，(NH4)₂SO₄质量250kg，MgSO₄质量30kg，玉米浆体积2.0m3，消泡油质量6kg，铜锌质量适量，定容体积35m³。

发酵底料基础配方：MnSO4质量25kg，FeSO₄质量25kg，KH₂PO₄质量160kg，K₂HPO₄质量160kg，H₃PO₄质量100kg，(NH4)₂SO₄质量800kg，MgSO₄质量250kg，玉米浆体积5.0m3，消泡油质量200kg，铜锌质量适量，定容体积240m³。

总氮基础配方：MnSO₄质量20kg，FeSO₄质量20kg，KH₂PO₄质量250kg，K₂HPO₄质量250kg，MgSO₄质量500kg，消泡油质量100kg，定容体积30m³。

1.1.3实验设备

体积为2500L的二级种子培养罐，5000L的三级种子培养罐，47000L的发酵罐，20000L配料罐，三级种子连消系统，底料连消系统，浓糖连消系统，硫铵连消系统，浓糖流加罐，硫铵流加罐，720型紫外分光光度计，100mL容量瓶，0～1000mL移液枪，1mL移液管，吸耳球，洗瓶等。

1.2实验设计

在现有三级种子基础配方上分别用质量浓度0.3，0.5，0.7，0.9g/L的磷酸甜菜碱替代氯化胆碱，定容30m³，接种量体积为1500L，OD为0.5的二级种子液，培养温度30℃，PH实测6.95，溶氧控制>30%，初糖流加量均不变，在成熟净OD均为0.45的情况下对比成熟周期，确定成熟周期最短时磷酸甜菜碱的用量即为最佳用量。

在现有发酵底料基础配方、定容体积、接种量、培养温度(37℃)、PH实测7.0、溶氧控制>30%、初糖质量浓度0.02g/L、发酵过程残糖质量浓度控制6.0g/L、NH⁺₄质量浓度控制2.0～4.0g/L，其他因素均不变的情况下，设计用磷酸甜菜碱替代氯化胆碱的单因素多水平实验，添加质量浓度分别为0.3，0.5，0.7，0.9g/L。对比因变量OD峰值、峰值周期、产酸质量浓度、转化率，最终确定磷酸甜菜碱在赖氨酸发酵底料中最佳用量。

在现有总氮配方基础上添加磷酸甜菜碱，设计起始流加时间、总氮中磷酸甜菜碱添加浓度、糖氮比(浓糖与总氮的流加体积比)的三因素多水平正交实验，对比转化率得出最佳添加质量浓度、流加起始时间和糖氮体积比。

1.3分析测定方法

1.3.1OD值检测方法

取1mL发酵液，用100mL容量瓶稀释100倍，使用720型分光光度计在600nm波长下检测OD值。

1.3.2发酵液中赖氨酸质量浓度的测定

赖氨酸质量浓度采用茚三酮显色法测定。

步骤1用赖氨酸标样配置质量浓度为10g/L赖氨酸盐酸盐标液，分别取2，3，4，5，6mL赖氨酸盐酸盐标液至100mL容量瓶中，用去离子水定容至100mL，得到质量浓度分别为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6g/L的赖氨酸盐酸盐标样。

步骤2发酵液稀释150～500倍数，用离心机3500r/min离心10min，得到样品上清液。

步骤3用1支10mL试管，取pH1.3的茚三酮溶液1mL，加入样品离心上清液1mL，再用5支10mL试管，各取PH1.3的茚三酮溶液1mL，分别加入质量浓度为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6g/L的赖氨酸盐酸盐标样1mL，摇匀后在沸水浴中加热10min，取出冷却至室温，在以上6支试管中继续各加8mL去离子水，摇匀后用720型分光光度计在475nm波长下检测吸光值。

步骤4在Excel中以赖氨酸盐酸盐标样质量浓度为纵坐标，吸光值为横坐标绘制标准曲线，得出标准曲线公式，再将样品吸光值代入标准曲线公式中计算出发酵液中赖氨酸质量浓度。赖氨酸发酵糖酸转化率计算公式为

糖酸转化率=(产量/加糖量)×100%

1.4数据统计方法

1)采用SAS随机区组分析法分析磷酸甜菜碱对三级种子活力影响。

2)采用SPSS软件设计影响磷酸甜菜碱流加因素的正交实验，并对实验结果做方差分析，确定最佳流加条件。

统计方法分析结果中的F表示自变量对因变量的影响大小；p表示自变量对因变量影响大小的显著度，当p>0.05时表示影响不显著或无统计学意义，当0.01<p<0.05时表示影响显著，当p<0.01时表示影响极其显著。

声明：本文所用图片、文字来源《分析仪器》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系删除

相关链接：氨基酸，甲硫氨酸，磷酸盐