基于宏基因组技术分析自然发酵羊肉香肠中微生物多样性及生物胺的代谢

发布时间：2024-01-09 17:02 编辑者：陈丹

羊肉发酵香肠是用羊肉制成的香肠，是香肠中的新品种，因其加工技术成熟、方便食用和耐贮存等特点备受关注。生物胺是一种分子质量低、难挥发的碱性物质，摄入的食物中如果生物胺含量较高可能会中毒，导致头痛、呕吐或者腹泻等不良症状出现。自然发酵香肠的发酵过程属于开放式多菌种混合发酵体系，其中具有氨基酸脱羧酶活性的微生物产生氨基酸脱羧酶将游离氨基酸脱羧生成相应的生物胺。

近日，西南民族大学食品科学与技术学院以不同发酵阶段的羊肉香肠为实验对象，采用高效液相色谱方法测定样品中的生物胺含量，采用宏基因组技术分析样品中的微生物组成及变化，对生物胺和微生物多样性进行相关性分析，并结合非冗余（NR）蛋白质序列、直系同源蛋白分组比对（eggNOG）数据库和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库对微生物和酶的丰度与功能进行注释，探究生物胺与微生物菌群的相关性，以及生物胺代谢与微生物和酶的关系，旨在为探究自然发酵羊肉香肠中生物胺的代谢机制提供科学依据。

1 羊肉香肠的生物胺测定结果

利用高效液相色谱分别确定了色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺的保留时间。以这8 种生物胺标准品制作不同质量浓度的混合标准品溶液，以峰面积比作为因变量，不同质量浓度（mg/L）作为自变量，绘制并得到标准曲线和方程，分别为y=0.034 9x＋0.004 3（R2=0.999 7）、y=0.693 2x-0.001 2（R2=0.999 9）、y=1.352 1x＋0.017 3（R2=0.999 8）、y=1.786 3x＋0.009 8（R2=0.999 9）、y=1.830 6x-0.002 0（R2=0.999 6）、y=1.520 2x＋0.009 0（R2=0.999 9）、y=1.755 7x-0.115 2（R2=0.999 2）和y=1.278 5x-0.088 4（R2=0.999 1）。通过标准曲线方程，计算出不同发酵阶段羊肉香肠样品中各种生物胺含量，结果如表1所示。

色胺、苯乙胺和腐胺在羊肉香肠发酵过程中差异不显著（P＞0.05）。尸胺和组胺含量变化没有明显的规律，而酪胺、亚精胺和精胺均呈现先上升后降低的趋势，只是酪胺的最大值出现在第5天，而亚精胺和精胺最大值则是在第14天。其中，组胺最终含量为1.26 mg/kg，酪胺最终为5.07 mg/kg，总生物胺为80.42 mg/kg，自制羊肉香肠的生物胺符合报道要求组胺、酪胺和总生物胺含量的规定，香肠的安全性符合要求。在8 种生物胺中，精胺含量最高，为羊肉香肠发酵过程中的主要生物胺，14 d达到最高值97.70 mg/kg，呈现先增加后减少的趋势；0 d与26 d的精胺含量与14 d呈显著差异；亚精胺和精胺一般与原料肉的品质、部位以及生理状况有关，是生物体内的生理多胺，虽然研究表明这两种胺对人体健康没有直接的不良影响，但可能与亚硝酸盐反应形成致癌的亚硝胺，因此，也需要控制其含量。

2 羊肉香肠中微生物的群落结构

提取羊肉香肠样品基因组，经宏基因组测序和去除低质量数据后，得到62 106 208 bp，包含67 377 条序列。对羊肉香肠样品进行物种注释，共鉴定出43 个门、60 个纲、112 个目、201 个科、465 个属和2 156 个种的微生物。

在细菌的属水平，丰度排名前30的细菌群落结构如图1 所示，较直观地展示了不同发酵阶段羊肉香肠中细菌群落构成的异同。第0 天，嗜血杆菌属（Haemophilus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、酒球菌属（Oenococcus）、李斯特菌属（Listeria）和弓形菌属（Arcobacter）相对丰度较高，分别为20.39%、18.82%、10.02%、5.24%和5.20%；第5天时，样品中相对丰度较高的细菌属为弧菌属（Vibrio）、葡萄球菌属、嗜血杆菌属、酒球菌属和明串珠菌属（Leuconostoc），其相对丰度分别为21.16%、17.79%、13.86%、6.50%和3.83%；到第14天时，葡萄球菌属相对丰度达到4 组样品的最高值，为43.95%，其次分别是嗜血杆菌属，相对丰度为11.73%，为4 个时间点的最低值，弧菌属的相对丰度为7.64%，酒球菌属和李斯特菌属的相对丰度也变为了4 个时期的最低值，分别为6.03%和3.15%；直到第26天，与第14天相比，相对丰度较大的细菌属类别不变，但相对丰度发生了改变，葡萄球菌属为25.39%、嗜血杆菌属为18.63%、酒球菌属为8.89%、弧菌属为4.79%、李斯特菌属为4.70%。

说明发酵羊肉香肠中的细菌构成较为复杂，不同发酵阶段的样品中的优势菌属不同，这可能是由于自然发酵这一生产方式导致。总体来讲，在自然发酵羊肉香肠样品中葡萄球菌属的占比较大，这是一类常见于发酵肉制品中的优势菌，葡萄球菌可以快速还原硝酸盐，使降解产物与肌红蛋白结合形成亚硝基红蛋白，赋予肉制品红润的色泽，同时还能够防止脂肪氧化。样品中具有相对丰度较高的嗜血杆菌属，这可能与原材料有关，羊肉或者猪肠衣自身携带有嗜血杆菌属，导致样品中这种微生物相对丰度较高，可能会引发食源性疾病，因此在选择原材料时应注意原料的品质，保证食品安全。

真菌在羊肉香肠样品中占比较小，相对丰度排名前3 0 的真菌属中，最大的是德巴利酵母菌属（Debaryomyces），其相对丰度仅为0.206%，在第14天时出现，其余的真菌属相比较细菌属而言，对生物胺的作用可以忽略不计。

3 羊肉香肠中细菌属水平结构与生物胺的相关性分析

羊肉香肠发酵过程中微生物菌群结构会发生变化，生物胺作为氨基酸脱羧的产物，其种类和含量与微生物的丰富度和多样性密切相关。使用Spearman相关性分析研究了羊肉发酵香肠样品中8 种生物胺和30 个优势细菌属之间的关系。结果表明，明串珠菌属、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、弧菌属、发光杆菌属（Photobacterium）和希瓦氏菌属（Shewanella）均与尸胺呈极显著（P＜0.01）正相关；与精胺呈显著（P＜0.05）负相关的15 种细菌分别为李斯特菌属、酒球菌属、弓形菌属、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属（Bacillus）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、短螺菌属（Brachyspira）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、Eggerthia、变浆体属（Anaplasma）、肠球菌属（Enterococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、奈瑟氏菌属（Neisseria）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）和分枝杆菌属（Mycolicibacterium）；与亚精胺呈显著（P＜0.05）负相关的4 种菌属分别为李斯特菌属、酒球菌属、弓形菌属和嗜血杆菌属；与酪胺呈显著（P＜0.05）负相关的5 种菌属分别为李斯特菌属、酒球菌属、弓形菌属、嗜血杆菌属和泛菌属（Pantoea），呈显著正相关的有假交替单胞菌属和发光杆菌属；与色胺呈显著（P＜0.05）正相关的是葡萄球菌属和链球菌属（Streptococcus）。

4 数据库注释分析

4.1 eggNOG数据库注释分析

将11 份样品测序得到的数据与eggNOG数据库进行比对，获得了每个基因对应的直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）注释情况，共鉴定出36 935 个COG功能单元，这些功能单元分属于23 个主要的功能大类。其中，基因数排名前3的主要是未知功能类9 190 个基因，氨基酸的转运和代谢3 242 个基因，复制、重组和修复2 936 个基因。

4.2 KEGG数据库注释分析

将NR基因在KEGG数据库中进行注释，结果如图4所示。11 份样品中共有39 319 个NR基因注释到KEGG的34 条代谢通路中，在第1水平的通路中，注释到新陈代谢通路的数量最多，共有26 273 条；其次是环境信息处理，共6 041 条；遗传信息处理，共3 795 条；细胞过程，共2 335 条；生命系统最少，仅有875 条。在新陈代谢通路的第2水平中，除4 203 条NR基因被注释到全局和总览图外，碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅酶因子和维生素的代谢是被注释最多的途径。KEGG数据库注释结果揭示了羊肉香肠中微生物主要通过调控碳水化合物代谢和氨基酸代谢过程影响香肠的品质，其中，与生物胺产生相关的代谢为氨基酸代谢。
不同发酵阶段羊肉香肠的KEGG代谢分析

将不同发酵阶段香肠样品的KEGG数据库中第1水平的丰富度进行绘图后发现，在羊肉香肠中，共有5 大类代谢通路，不同时间的微生物基因在同一类中注释结果存在差异，但无论在哪大类代谢通路中，第14天所比对的基因在同一类别中比例都最高，而第0天所注释的结果比例都最低，说明第14天的5大功能最旺盛。其中，新陈代谢功能尤其突出，表明14 d是自然发酵羊肉香肠中微生物代谢活动最为旺盛的时间。

4.3 不同发酵阶段羊肉香肠的新陈代谢类型分析

在新陈代谢通路的第2水平中，每个阶段注释到的第2水平所含有丰度各不相同。第0天各种代谢的丰度均低于第14天，在第0天各种代谢中能量代谢最为旺盛；在第5、14、26天时，除去NR基因被注释到的全局和总览图外，碳水化合物代谢最旺盛，其次是氨基酸代谢和能量代谢。11 份样品中共有13 条代谢通路中出现生物胺，从KEGG数据库的第2水平来讲属于其中的5 类，分别为氨基酸代谢6 条，其他氨基酸代谢的代谢有2 条，能量代谢1 条，辅酶因子和维生素的代谢1 条，其他次生代谢物的生物合成有3 条。

5 与生物胺代谢相关的通路分析

羊肉香肠样品分别结合KEGG Pathway中ko00380、ko00360、ko00350和ko00950注释的色胺、苯乙胺和酪胺代谢通路图。色胺、苯乙胺和酪胺都在单胺氧化酶（EC: 1.4.3.4）的作用下被降解，通过在KEGG数据库中对酶的来源进行追踪发现，单胺氧化酶主要由3 种菌产生，分别为嗜冷杆菌属（Psychrobacter sp.）YP14、假单胞菌属OV144和嗜冷杆菌属YGAH215。样品去宿主基因后，与KEGG数据库进行比对，没有注释到合成这3 种胺的微生物，推测样品中色胺、苯乙胺和酪胺的形成可能是由于原料肉中内源酶的催化作用。

羊肉香肠样品结合KEGG Pathway 中ko00310、ko00480注释的尸胺代谢通路图。尸胺只由微生物通过赖氨酸脱羧酶（EC: 4.1.1.18）作用于赖氨酸脱羧形成，样品中具有这种能力的微生物只有1 种菌，为Photobacterium piscicola。尸胺降解的途径只有1 条，涉及到的微生物有2 种（假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas sp.）JB197、半透明假交替单胞菌（Pseudoalteromonas translucida）），都是通过亚精胺合酶（EC: 2.5.1.16）降解尸胺。

结合KEGG Pathway中ko00330、ko00480注释的腐胺代谢通路图。合成腐胺的路径有2 条，一条为胍基丁胺在胍基丁酶（EC: 3.5.3.11）的作用下合成腐胺，产生这种酶的微生物有3 种，分别为木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、Vibrio rumoiensis、马葡萄球菌（Staphylococcus equorum）；另一条合成途径是鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶（EC: 4.1.1.17）作用下脱羧形成腐胺，涉及的微生物有荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）、嗜冷杆菌属YGAH215和嗜冷杆菌属1501（2011）。腐胺的降解途径有氧化、转移等方式，其中产生carboxynorspermidine synthase（EC: 1.5.1.43）的微生物有Vibrio sp.、V. rumoiensis、噬海藻弧菌（V. algivorus），产生亚精胺合酶（EC: 2.5.1.16）的微生物有假交替单胞菌属JB197和半透明假交替单胞菌，产生二胺N-乙酰基转移酶（EC: 2.3.1.57）的微生物有Vibrio sp.、Leuconostoc suionicum、V. aphrogenes、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、葡萄球菌属OJ82和木糖葡萄球菌。

结合KEGG Pathway中ko00330、ko00410和ko00480注释的亚精胺和精胺代谢通路图。可以看出，亚精胺的合成有3 条途径，第1条是腐胺在亚精胺合酶（EC: 2.5.1.16）的作用下生成亚精胺，涉及到的微生物有假交替单胞菌属JB197和半透明假交替单胞菌；另外一条途径是羧基亚精胺在羧基精胺脱羧酶（EC: 4.1.1.96）作用下生成亚精胺，产生这种酶的微生物是Vibrio sp.和V. aphrogenes；第3条途径则是谷胱甘肽亚精胺在谷胱甘肽亚精胺酰胺酶（EC: 3.5.1.78）的作用下合成亚精胺，样品中产生这种酶的微生物只有发光杆菌属（Photobacterium sp.）NCIMB 13483。对于亚精胺的降解有2 条途径，一条途径是亚精胺在谷胱甘肽亚精胺合酶（EC: 6.3.1.8）作用下转化为谷胱甘肽亚精胺，产生这种酶的微生物只有发光杆菌属NCIMB 13483；另一条途径则是在精胺合酶（EC: 2.5.1.22）作用下降解为精胺，样品中产生这种酶的微生物只有硝化螺旋细菌（Nitrospirae bacterium）。

组胺可以通过组氨酸脱羧形成，同时可以通过基团转移、酶氧化、化学合成等途径被降解，样品去宿主基因后，与KEGG数据库进行比对，没有注释到代谢组胺的微生物，推测样品中组胺的代谢可能是由于原料肉中内源酶的作用，导致样品中检测出低含量的组胺。

6 讨论

本研究发现Vibrio sp.和V. aphrogenes两种弧菌既能合成腐胺又能降解腐胺，同时还可以降解亚精胺；嗜冷杆菌属YGAH215不仅降解色胺、苯乙胺和酪胺，还能合成腐胺；假交替单胞菌属JB197不仅能降解尸胺和腐胺，同时能合成亚精胺；木糖葡萄球菌不仅能产生合成腐胺的酶，还可以产生降解腐胺的酶。

大部分研究人员认为，生物胺产生能力不能归属到分类种，只能归属到菌株。但本研究却发现，荧光假单胞菌不参与酪胺和组胺的代谢，只与腐胺的合成有关；木糖葡萄球菌不参与组胺和酪胺的代谢，只与腐胺的代谢有关；肠球菌属、乳杆菌属和乳球菌属不代谢组胺。已有报道和本研究结果不一致，可能是由于生物胺的形成应该归属于细菌菌株而不是微生物的分类种或者属。

7 结论

研究发现羊肉香肠中微生物多样性丰富，葡萄球菌属、弧菌属、酒球菌属和嗜血杆菌属是主要优势细菌属；检测出8 种生物胺，其中精胺含量最高。相关性分析表明尸胺与明串珠菌属和假交替单胞菌属等5 种细菌属呈极显著正相关；精胺与酒球菌属和芽孢杆菌属等15 种细菌属呈显著负相关；亚精胺与酒球菌属和弓形菌属等4 种菌属呈显著负相关；酪胺与酒球菌属和泛菌属等5 种菌属呈显著负相关，而与假交替单胞菌属和发光杆菌属呈显著正相关；色胺与葡萄球菌属和链球菌属呈显著正相关；不存在与组胺、腐胺和苯乙胺显著相关的细菌属。经过eggNOG、KEGG数据库比对，分别注释到36 935、39 319 个基因，主要为碳水化合物代谢和氨基酸代谢。经KEGG数据库注释后，发现有代谢尸胺、腐胺、精胺和亚精胺的细菌和酶，有降解色胺、苯乙胺和酪胺的细菌和酶，没有代谢组胺的细菌和酶，色胺、苯乙胺、酪胺和组胺的合成可能由于内源酶的作用。