4、操作步骤

（1）试样处理

①新鲜果蔬试样：称取鲜样50.0g～100.0g，放入组织捣碎机的杯中，加入等重量的草酸浸提剂，快速捣碎1min，将试样打成浆状。试样处理的整个过程应在10min中内完成，以免Vc被空气氧化。用小烧杯称取浆状物10g～30g(准确至0.lg，含还原型Vc1mg～5mg)，放入100mL容量瓶中，用草酸溶液定容，若有泡沫可加2滴辛醇除去。过滤，若滤液色深，影响滴定终点的判定时，可加1勺～2勺白陶土脱色。若样液不易过滤，可用离心法分离。

②多汁果蔬试样：可用纱布压汁后再用脱脂棉花快速过滤，量取10mL～20mL汁液，立即用草酸溶液定容至100mL。

③干试样称取：1g～4g(准确至0.001g，含还原型Vc 1mg～5mg)放入研钵中，加入草酸溶液研磨成浆状液，洗入100mL容量瓶中，用草酸定容。

④含有还原性物质的试样含有较多Fe²⁺的样品可用乙酸〔ψCH₃000H)=80%]代替草酸作为浸提剂。亚硫化脱水样品，可于稀释至一定容量之前加入20 mL丙酮，以除去SO₂的干扰。

（2）测定：吸取无色滤液5.00ml～10.00mL(使含Vc约0.2 mg～1mg范围)放入50mL三角瓶中，用棕色半微量滴定管中装的2,6-二氯靛酚标准溶液滴定至浅红色，约在15s内不褪色为终点。同时以浸提剂做空白试验(空白值约0.08mL～O.10mL)。

5、结果计算

Vc,mg·kg^-1=(V一V₀) ×1000×T÷m

式中:V——滴定样品液所用染料溶液体积,mL;

Vo——滴定空白所用染料溶液体积,mL;

T——染料溶液的滴定度，mg·mL;

m——滴定时样品溶液中样品的质量，g。

两次测定结果允许误差:

6、注意事项

（1）偏磷酸是Vc的最佳稳定剂，且具有沉淀蛋白质的作用。但其价格较贵，在室温下放置易转化为正磷酸，降低对Vc的稳定性。草酸廉价易得，有与偏磷酸相近的稳定性。而乙酸适于浸提含有Fe²⁺的样品。

（2）草酸不应置于日光下，以免产生过氧化物。当有催化剂(如Cu2+)存在时，过氧化物能破坏Vc。

（3）6-二氯靛酚固体试剂有时含有分解产物，染料溶液长久贮存时也会生成分解产物，从而使滴定终点不灵敏，因此应在使用前检查。检查方法:取15mL染料溶液加入过量的Vc溶液，若此时溶液仍带有颜色，表示此溶液已不能使用。

（4）使用白陶土时，要对每批新的白陶土测定对Vc的回收率。

（5）试样中可能有其它还原性物质也可使染料还原。但其还原染料的速度较慢，故滴定终点以浅色在15s不褪色为准。

四、维生素C总量的测定（2，4-二硝基苯肼比色法）

1、方法原理

维生紊C总量包括还原型Vc、脱氢型Vc和二酮古乐糖酸。先将试样中的还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，进一步水解为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2,4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎。其呈色的强度与二酮古乐糖酸浓度成正比，可以比色定量。

2、试剂

（1）草酸溶液［(H₂C₂O₄·2H₂0)=10g·L^-1]:10g草酸[H₂C₂O₄·2H₂0，化学纯〕溶于水，稀释至1L;

（2）草酸溶液［((H₂C₂O₄·2H₂0)=20g·L^-1]:20g草酸((H₂C₂O₄·2H₂0，化学纯)溶于水，稀释至1L;

（3）酸处理活性炭:取活性炭200g，加入盐酸溶液［ψ（HC1)=10%]100mL，煮沸后，抽气过滤，再用沸水1000 mL煮沸过滤，重复用水洗至溶液中无Fe²⁺离子(用KSCN溶液试验无红色)，放在100^oC～120℃烘干;

（4）2,4-二硝基苯肼溶液:称取2,4-二硝基苯肼(C₆H₆N₄O₄，分析纯)2.00g溶解于100 mL硫酸溶液中。

（5）硫酸溶液〔e(H₂SO₄)=4.5 mol·L^-1]:量取浓H₂S0₄(p=1.84g·cm^-3，分析纯)250mL，慢慢倒入750mL水中，边加边搅拌。

（6）硫脲溶液:用50%乙醇溶液溶解5.00g硫脲[(NH₂)₂CS，分析纯〕，使其最终体积为50mL。

（7）硫酸溶液:量取浓硫酸90mL，慢慢倒入10mL水中。

（8）标准Vc溶液:称取VcO.020g溶解于草酸溶液中，移入lOOmL容量瓶中并定容，吸取此溶液50 mL，加入活性炭0.1g,摇1 min，过滤。吸取此溶液5mL于100mL容量瓶中，用草酸溶液(试剂1)稀释定容。此Vc工作液为10mg·L^-1。

3、操作步骤

（1）试样处理：称取适量试样加等量的草酸溶液，在组织捣碎机中打成浆状。取浆状物20g用草酸溶液移入100mL容量瓶中，定容过滤。

（2）试样中总Vc的测定：取滤液10mL，加入草酸溶液10mL(总Vc约1mg·L^-1～10 mg·L^-1)，加一勺活性炭。摇1min,静置过滤。

各取滤液2mL于样品管和样品空白管中，各管加入1滴硫脉溶液。于样品管中加入2,4-二硝基苯磷溶液0.5mL，两管都加上盖子，里于37℃保温箱中保温3h。

然后取出样品管放入冰水中(终止反应)。样品空白管取出后冷却至室温，然后加入2,4-二硝基苯磷溶液0.5mL。然后将样品管和样品空白管皆置于冰浴中，从滴定管中滴加硫酸2 mL于各管中，边滴边摇试管(防止溶液温度上升，溶液中糖炭化而转黑色)。

将各管从冰裕中取出，在室温下放置30min后，立即在分光光度计540nm波长处比色，读取吸收值，根据吸收值从标准曲线查出相应含量。

（3）标准曲线的绘制：吸取Vc标准工作液10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL稀释至50 mL，即此系列含有2mg·L^-1,4mg·L^-1,6mg·L^-1,8mg·L^-1,10mg·L^-1，的V_c标准溶液。各取2mL于各标准管中，然后按上述2步骤测定。以Vc浓度系列为横座标，以吸收值(A)为纵座标作标准曲线。

4、结果计算

式中:P——从标准曲线查得的mL稀释液中所含总抗坏血酸的质量mg·L^-1;

m——每1mL样品稀释液所含样品的质量，g;

10^-3——将mL换算成L的系数;

1000——1000g样品中总Vc的含量。

5、注意事项

（1）硫脲可防止Vc被氧化，且可帮助脎的形成，最终溶液中硫脉的浓度应一致，否则影响色度。

（2）加入硫酸溶液后，试管从冰水中取出，溶液颜色会继续变深，所以必须准确加入H₂SO₄后于30min内比色。

参考资料：土壤农业化学分析方法