杂色曲霉素检测

杂色曲霉素是由杂色曲霉、构巢曲霉等产生的有毒代谢产物。该毒素是致癌物质，主要污染大米、玉米、小麦等谷物和花生、黄豆。杂色曲霉毒的化学结构式如图21—1。

杂色曲霉素为淡黄色结晶，分子式为C18 H12O6，分子量为324。在紫外光灯下具有暗砖红色荧光。杂色曲霉素溶于极性弱的溶剂中，如三氯甲烷或比三氯甲烷极性更弱的溶剂，微溶于很多其他溶剂，不溶于水。由于毒素带酚羟基，羟基在一定的条件下发生水解而影响对光的吸收性能，当用分光光度法测定毒素时必然影响结果，故实验时必须注意酸和溶剂。目前我国还没有制定杂色曲霉素的卫生标准，采用的分析方法主要是薄层色谱法和高效液相色谱法。但高效液相色谱法的回收率和检出限度均不理想，现介绍薄层色谱标准检测方法。

一、适用范围

本方法适用于大米、玉米、小麦、黄豆及花生等各种食品中杂色曲霉素的测定。

二、原理

样品中的杂色曲霉素经提取、净化、浓缩、薄层展开后，用三氯化铝显色，再经加热产生一种在紫外光下显示黄色荧光的物质，根据其在薄层上显示的荧光最低检出量来测定样品中杂色曲霉素的含量。

三、试剂

1、三氯甲烷；

2、正己烷或石油醚(30～600C或60～900C)；

3、甲醇；

4、苯；

5、冰乙酸；

6、甲酸；

7、95％乙醇；

8、4％氯化钠溶液；

9、20％三氯化铝-乙醇溶液：称取20g三氯化铝(A1C113·6H2O)，溶于100mL乙醇中，过滤，室温保存；

10、杂色曲霉素标准溶液：用杂色曲霉素标准品配制成每毫升相当于lOμg的苯溶液。用紫外分光光度计标定其浓度(最大吸收峰的波长325nm，分子量324，摩尔消光系数15200)，并作硅胶薄层色谱纯度鉴定，避光，放置于40C冰箱中保存；

11、杂色曲霉素标准使用液：用苯将10μg／mL的杂色曲霉素标准溶液稀释成每毫升相当于l和0.4μg的杂色曲霉素溶液。避光，放置于4℃冰箱中保存。

四、仪器

1、小型粉碎机；

2、样筛；

3、电动振荡器；

4、全玻璃浓缩器；

5、玻璃板：l0cm×10cm与10cm×18.5cm两种；

6、展开槽：内长10cm、宽4.5cm、高17cm与内长11.5cm、宽60cm、高19cm；

7、喷雾器；

8、空气泵或油泵；

9、紫外光灯：波长365nm；

10、微量注射器。

五、操作步骤

(一)样品溶液的制备

称取20g过20目筛的大米、玉米、小麦及黄豆样品(花生样品过10目筛孔)，置于具塞锥形瓶中，加80mL甲醇-4 %氯化钠水溶液(90+lO)，振荡30min，过滤。收集样液40mL(黄豆、花生样品则取20mL，加入20mL提取剂)，移入250mL分液漏斗中，再加入25mL4％氯化钠溶液(使甲醇与水之体积比为55:45)和25mL石油醚，振摇2min，静置分层。上层石油醚溶液置锥形瓶中，下层溶液仍移入原分液漏斗中，再用25mL石油醚提取一次。最后将两次上层的石油醚溶液合并，加入25mL甲醇-4％氯化钠水溶液(55+45)，振摇30s[黄豆、花生样品则加入25mL甲醇-4％氯化钠溶液(70+30)，振摇30s]，将下层并于原甲醇水层中，重复用甲醇-4％氯化钠溶液(55+45)提取两次[黄豆、花生样品重复用甲醇-4％氯化钠溶液(70+30)提取一次]，以提取该层的杂色曲霉素。下层溶液合并后加30mL三氯甲烷(黄豆、花生样品除加三氯甲烷外，再加13mL4％氯化钠溶液，使甲醇与水的体积比为55:45)振摇2min，静置。待上层混浊液有部分澄清时，即可将下层溶液经放有约10g无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于蒸发皿中。于分液漏斗中再加10mL三氯甲烷，重复提取一次，将该下层溶液和用少量三氯甲烷洗滤器的洗液一并放入蒸发皿中。将蒸发皿置于65℃水浴上挥干，然后再在冰浴上放置2～3min，加1.OmL苯将残留物充分混匀，置入小试管中。或将以上蒸发皿中残留物用三氯甲烷移于浓缩管中，于65℃用减压吹气法浓缩至干，加入1.OmL苯，供色谱测定，此1mL大米、玉米及小麦样液各相当于10g样品，1mL黄豆与花生样液则各相当于5g样品。

(二)薄层色谱测定

1、薄层板的制备：称取5g硅胶G，加相当于硅胶量2～3倍左右的水，用力研磨1～2 min至成糊状后，立即倒于涂布器内，铺成10cm×10cm、厚度0.3mm薄层板五块。

2、点样：取两块10cm×10cm薄层板，在距板下端各0.8～1cm基线上滴加标准使用液与样液如下：距左边缘0.8～1cm处各滴加10μL0.4μg/mL标准使用液，在距左边缘4cm处各滴加80μL样液(黄豆、花生样品为40μL)，然后在第二块板的样液点上加滴10μL O.4μg／mL标准使用液，在滴加样液时可用吹风机冷风边吹边加。

3、展开：

(1)展开剂

横展剂：乙醚一正己烷一苯一三氯甲烷一甲酸(3+9+1.5+1.5+O.6)15.6 mL(由于此混合液不成一相，每一展开槽的用量须单独配制)。用前充分摇匀，一并倒入槽内使用。

纵展剂：苯-甲醇-冰乙酸(90+8+2或92.5+6+1.5)15mL。一并倒入槽内使用。

(2)横向展开：将靠近标准点的一边放入盛有横展剂的槽内，展至9cm左右取出挥干。

(3)纵向展开：将靠近标准点与样品点的一边放入盛有纵展剂的槽内，展开9cm左右取出挥干。

4、显荧光：在薄层板上喷20%三氯化铝-乙醇溶液，置80℃，加热10min，立即在紫外光灯下观察结果，待薄层板冷却后再薄薄地喷第二次(不需

5、观察与评定：在紫外光灯下观察，若第二块板的第二点在标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板的相同位置上未出现荧光点，则样品中杂色曲霉素含量在5μg／kg以下(黄豆、花生样品为20μg／kg)；若出现荧光点的强度与标准点的最低检出量的荧光强度相等，而且此荧光点又同第二板样液的标准点重叠，则样品中杂色曲霉素含量为5μg／kg(黄豆、花生样品为20μg／kg)；若出现荧光强度比标准点的最低检出量强，则根据其荧光强度估计减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。在喷三氯化铝第一、二次后分别进行观察评定，两次结果应一致。若结果为阳性，则将薄层板放暗处10 min，再观察一次，如样品仍为阳性，进一步做确证试验，即在距薄层板(10cm×18.5cm)F端3cm的基线上滴加一个点的10μL O.4μg／mL标准使用液与3个点的样液，每点16μL。在样液的一个点上再加滴10μLO.4μg／mL标准使用液，另一点上再加滴10μL lμg／mL标准使用液。于各点上再加一小滴三氟乙酸，放暗处反应10min，热风吹5min，使薄层板上的温度不高于400C，用冰乙酸一苯(10+90)展开1～2次，直至杂色曲霉素衍生物与杂质分开为止。展开时要避光，以下显荧光步骤同“(4)显荧光”项下。最后将板在紫外光灯下观察，如样液为阳性，应产生与杂色曲霉素标准重叠的衍生物。确证法的灵敏度：大米、玉米、小麦为25μg／kg(黄豆、花生样品为50μg／kg)。

6、计算：

式中：X——杂色曲霉素含量，μg/kg；

 V1——样液浓缩后体积，mL；

V2——出现最低荧光样液的滴加体积，mL；

D——浓缩样液的总稀释倍数；

m——浓缩样液中所相当的样品质量，g；

0.004——杂色曲霉素的最低检出量，μg。

六、注意事项

(一)在大米、玉米或小麦样品中加入杂色曲霉素5μg/kg时(黄豆、花生样品中加入水平为20μg／kg)，用双向薄层色谱法测定，杂色曲霉素的回收率均达75％mL，故认为用本方法测定大米、玉米及小麦的方法灵敏度为5μg/kg，黄豆、花生则为20μg/kg。做样品中杂色曲霉素回收率时，须先将所需的杂色曲霉素标准液加入准备称样的具塞锥形瓶中，以吹风机用冷风将标准液的溶剂吹干后，再将样品加入，以下操作方法与样品测定相同。

(二)在薄层色谱上喷以三氯化铝乙醇溶液，使杂色曲霉素分子结构上的酮基与羟基和铝离子结合成络合物后，产生黄色荧光，其荧光强度较杂色曲霉素本身具有的暗砖红色荧光约提高100倍。

(三)由于杂色曲霉素微溶于石油醚，所以还需用甲醇-4％氯化钠溶液提回石油醚层中微量的杂色曲霉素。

(四)展开剂用量随展开槽大小而定，用量要合适，过多的展开剂会将板上的点浸泡在展开剂中。

(五)薄薄地喷第二次三氯化铝一乙醇溶液，其作用能消除板上微弱的底色。

(六)由于在薄层色谱上用目视能区分与杂色曲霉素最低检出量相差±20%剂量的荧光强度，因此用目视定量的误差范围为±20%左右。

(七)在200多份的样品测定中，有一份在薄层色谱测定中样液在标准相应处出现类似杂色曲霉素的荧光点，但此点在暗处过10min后即消失，因此如为阳性样品，须将板在暗处放10min后再观察一次，以避免样品的假阳性。

参考资料：食品卫生微生物检验标准手册