胆碱在乳品中的应用和测定

1关键词：胆碱、胆碱氧化酶、过氧化物酶、磷脂酶D
一、胆碱
胆碱是一种强有机碱，是卵磷脂的组成成分，也存在于神经鞘磷脂之中，是机体可变甲基的一个来源而作用于合成甲基的产物，同时又是乙酰胆碱的前体。
胆碱对人体的作用相当广泛，如促进脑发育和提高记忆能力、调控细胞凋亡、促进脂肪代谢、促进体内甲基代谢、降低血清胆固醇等。因此，在乳品中添加胆碱越来越受到重视，世界许多国家，包括中国在内，均已将胆碱批准作为营养食品添加剂。
国标GB5413.20-2013婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定中规定了两种方法，酶比色法和雷氏盐分光光度法。鉴于目前传统的检测方法（雷氏盐比色法）不同程度的存在操作繁琐、选择性差、干扰因素多等缺陷，一般大型企业都会选择酶比色法。
二、胆碱的含量测定方法（酶比色法）
1、原理：胆碱经酸水解后边成游离态的胆碱，再经酶氧化后与显色剂反应生成有色物质，其颜色的深浅在一定浓度范围内与胆碱含量成正比。
2、试剂
盐酸（1mol/L）:量取85ml的浓盐酸加水稀释至1000ml；
盐酸（3mol/L）：量取125ml的浓盐酸加水稀释至1000ml；
氢氧化钠溶液（500g/L）：称取500g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000ml；
Tris缓冲溶液（0.05mol/L，PH=8.0±0.2）：称取6.057g三羟基氨基甲烷溶于500ml蒸馏水中，用1mol/L盐酸调PH至8.0±0.2，用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在4℃冰箱可保存一个月；
酶反应显色剂：取100-120活力单位的胆碱氧化酶、250-280活力单位的过氧化物酶、75-100活力单位的磷脂酶D、15mg 4-氨基安替比林和50ml苯酚置于100ml的容量瓶中，用0.05mol/L Tris缓冲液稀释至刻度。（现用现配）
胆碱氢氧化物标准品：称取102±2℃烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐523mg置于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度即为储备液（冰箱冷藏不超过1周）；吸取储备液10.0ml溶液与100ml容量瓶中，用水稀释至刻度即为工作液（现用现配）。
3、简易步骤
3.1样品制备：称取5g混合均匀的固体样品（液体20g），于100ml锥形瓶中，加入30ml1mol/L盐酸溶液（液体样品10ml 3mol/L盐酸溶液）；70℃水浴，水解3小时（每隔半小时摇匀一次），冷却，用氢氧化钠溶液调PH为3.5-4.0，转入50ml容量瓶中用蒸馏水定容；过滤水解液，滤液应是澄清，否则再虑，滤液放冰箱冷藏可保存3天。
3.2标曲制作：分别吸取2ml、4ml、6ml、8ml胆碱标准工作液于10ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度；准备6支试管，一个做空白加入0.1ml蒸馏水，另5支分别加入0.1ml标准溶液和4个稀释梯度，再每个试管加入3ml酶反应显色剂；用密封保护膜盖住试管，混匀，把试管置于37℃水浴中保温反应15min；时间到后将溶液取出冷却至室温，再波长505nm处，用蒸馏水做空白，测定吸光值制作标准曲线。
3.3样品测定：将每个样品准备2支试管，分别加入0.1ml样品滤液，一个加入蒸馏水3ml做空白，一个加入3ml酶反应显色剂；用密封保护膜盖住试管，混匀，把试管置于37℃水浴中保温反应15min；时间到后将溶液取出冷却至室温，再波长505nm处，用蒸馏水做空白，测定吸光值，然后计算样品中胆碱的含量。
三、酶比色法中源叶能为您提供的试剂
1、胆碱氧化酶：CAS号 9028-67-5
2、过氧化物酶：CAS号 9003-99-0
源叶货号S10061、S10062、S10063、S10064（不同纯度的）
3、磷脂酶D : CAS号 9001-87-0
4、4-氨基安替比林: CAS号 83-07-8