蛋清溶菌酶的提取及其酶学性质探究（一）

溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）又被称为胞壁质酶（Muramidase）、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase），可以选择性地水解细菌细胞壁上肽聚糖的β-1，4糖苷键，使得细胞在溶解死亡的同时，不破坏其它组织，是一种天然、安全性能良好的杀菌剂和防腐剂，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，可广泛应用于食品生物防腐、医药、日用化工等行业。目前研究表明，鸡蛋蛋清是溶菌酶生产的主要原料，其溶菌酶的含量可达到0.2%～0.4%，然而，蛋清中含有多种蛋白质，需对蛋清中的溶菌酶进行分离提纯。

目前，常用的溶菌酶提纯方法包括结晶法、亲和膜色谱法、离子交换法、超滤法等。Curcio等采用静态膜结晶法以NaCl为沉淀剂，MgCl₂溶液为洗脱液，醋酸钠溶液为缓冲液调节蛋清液pH值，静置1d后溶菌酶以晶体形式析出，其操作简单，然而生产周期长，原料利用率低，且制得的溶菌酶纯度较低。Ho用活性红120对磁性壳聚糖微球表面进行改性，并采用磷酸盐缓冲液作为洗脱液，制得的溶菌酶解吸率为92.6%，回收率为89.1%，其制得的溶菌酶纯度高，然而操作难度较大，成本高，难以应用于工业化生产。离子交换法可利用离子交换剂与蛋白质之间的结合力不同起到分离效果。余海芬等采用阳离子交换树脂法，以硫酸铵为洗脱液提取蛋清溶菌酶，制得溶菌酶比酶活达9500U/mg，其操作简单，生产周期短，效率高，适合工业化生产。超滤法以超滤膜两端压力差为动力，通过控制膜孔径大小进行蛋白质的分离。Mayani等用超滤法所制得的蛋清溶菌酶纯品纯度达96%，回收率为75%，其操作简单、快速，相较其它方法条件温和，是生物工业领域中较有潜能的蛋白质分离技术。综上，现有的溶菌酶提取方法均存在一定的缺陷，因此，本研究协同使用离子交换法、超滤法，研究一种新型、高效的提纯溶菌酶的方法，即选用724阳离子交换树脂对溶菌酶进行特异性吸附，洗脱后经二步超滤获得精制溶菌酶，经单因素试验、Box-Behnken试验优化提纯工艺参数，并对提纯后的溶菌酶酶学性质进行初步表征。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜鸡蛋，市售；溶菌酶标准品，南京建成生物有限公司；溶壁微球菌（MicrococcuslysodeikticusFleming，保藏编号：GＩM1.132），广东省微生物保藏中心；724大孔弱酸性阳离子交换树脂，郑州勤实科技有限公司；蛋白质标准品，南京建成生物有限公司；其它试剂均为分析纯级试剂。

pH计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；高速冷冻离心机，安徽嘉文仪器装备有限公司；可见-紫外分光光度计，上海棱光技术有限公司；YXQ-LＳ-18ＳＩ立式压力蒸汽灭菌器、ＳW-GＪ-1R超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；GXZ-300D生化培养箱，宁波东南仪器有限公司；DHG-9194A电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 提取溶菌酶的工艺流程

蛋清搅拌、过滤→树脂预处理（724大孔弱酸性阳离子交换树脂提取蛋清液中的溶菌酶，盐酸、氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸泡时间均为10h）→吸附→洗脱→超滤技术辅助提纯、脱盐→冷冻干燥得溶菌酶纯品。

1.2.2 工艺优化

1.2.2.1 单因素试验

以树脂用量、蛋清滤液pH值、洗脱液浓度、洗脱时间为考察因素，测定洗脱液中溶菌酶质量浓度（mg/mL）及比活力（U/mg），并以溶菌酶的比活力（U/mg）为指标考察阳离子交换法的单因素试验结果。

1.2.2.2 Box-Behnken试验

在单因素试验的基础上，选择树脂用量（A）、洗脱液NaCl浓度（B）、蛋清滤液pH值（C）、洗脱时间（D）4个因素，每个因素选取低、中、高3个水平（表1），采用4因素3水平的响应曲面方法设计试验，并以溶菌酶比活力为指标，确定最佳提取工艺。

1.2.2.3 超滤试验

将阳离子交换法所得到比活力最高的洗脱液，置于不同转速、时间下进行离心超滤（截留分子质量为50ku），弃上层液，所得下层液于6500×g，20min离心进行二步超滤（3ku），留上层浓缩液，并以酶含量、比活力为考察指标，探究最优超滤条件。

1.2.3 溶菌酶含量及比活力测定方法

1.2.3.1 溶菌酶含量的测定

参考《鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定分光光度法》（GB/T25879-2010），略有改动。以0.9%NaCl溶液为参比液，在波长281nm处依次测定各溶菌酶标准液吸光度，绘制标准曲线。取试样1mL，用0.9%NaCl溶液稀释定容至25mL，混匀，在波长281nm处测定试样溶液的吸光度，平行测定3次，由标准曲线回归方程计算试样的溶菌酶浓度。

1.2.3.2 溶菌酶比活力的测定

参照《溶菌酶活性检测方法》（GB/T30990-2014），略有改动。于待测管中加入0.4mL待测酶液，再加入2mL溶壁微球菌菌液后开始计时，在波长450nm处分别反应15s和75s后，记录吸光度A₁₅和A₇₅。按每分钟较OD₄₅₀值下降0.001为1个活力单位（U）定义，计算酶活力，见式（1）。

式中，E_A—溶菌酶比活力（U/mg）；E_w—所测酶液中溶菌酶含量（mg）。

1.2.4 溶菌酶相对酶活的测定

测定溶菌酶在不同条件下的酶活，计酶活最高值为100%，相对酶活为在不同条件下酶活与最高酶活的百分比。

1.2.5 溶菌酶产品纯度鉴定

参照Laemmli等的聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）检测1.2.1节中吸附溶菌酶的洗脱液和超滤酶液的纯度。电泳结束后，使用凝胶成像仪采集图像，ＩmageLab

5.2.1 软件分析图像。

1.2.6 蛋清溶菌酶部分酶学性质的探究

以1.2.1节中经过优化后制得的溶菌酶为样品酶，探究pH值、温度、金属离子、表面活性剂对溶菌酶酶活的影响，以及该酶的温度和pH稳定性。

1.2.6.1 pH值对溶菌酶酶活的影响

使用不同pH值（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）的生理盐水配制成质量浓度为20g/mL的酶液，25℃水浴30min后，按1.2.4节所述方法测定相对酶活（%）。

1.2.6.2 温度对溶菌酶酶活的影响

使用pH值为7.0的生理盐水配制成质量浓度为20g/mL的酶液，水浴加热至不同温度（20，30，40，50，60，70，80℃），保温30min后，测定相对酶活（%）。

1.2.6.3 溶菌酶的pH稳定性

使用不同pH值（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）的生理盐水配制成质量浓度为20μg/mL的酶液，并分别反应30，60，90min后，测定相对酶活（%）。

1.2.6.4 溶菌酶的温度稳定性

使用pH值为7.0的生理盐水，配制成质量浓度为20μg/mL的酶液，水浴加热至不同温度（30，40，50，60，70，80℃），保温30，60，90min后，测定相对酶活（%）。

1.2.6.5 金属离子对溶菌酶酶活的影响

用蒸馏水配制成质量浓度为20μg/mL的酶液，加入等体积的不同金属离子（Na⁺，K⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Mg²⁺）溶液，使溶液中最终金属离子含量为0.01mol/L，同时设空白对照，25℃水浴30min后，测定相对酶活（%）。

1.2.6.6 表面活性剂对溶菌酶酶活的影响

使用pH值为7.0的生理盐水配制成质量浓度为20μg/mL的酶液，等体积加入体积分数10%的甘油、Tween20、Tween40、Tween80，设空白对照，25℃水浴30min后，测定相对酶活（%）。

1.2.7 数据处理

采用Design-Expert8.0.6软件响应面设计、数据分析、回归模型建立，采用OriginPro8.0做图；试验数据采用SPSS19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 阳离子交换法单因素优化

2.1.1 树脂用量优化

由图1可知，当蛋清树脂比为10∶2时，溶菌酶比活力达到最大值14997.78U/mg，之后随着树脂含量的增加，溶菌酶比活力缓慢下降。而酶含量随蛋清树脂比的增加而增加，在蛋清树脂比到达10∶2.5之后，增加缓慢。由此可知，当蛋清树脂比为10∶2.5时，所得溶菌酶的比活力较高，树脂用量合适，适宜提取分离溶菌酶。2.1.2蛋清滤液pH值优化由图2可知，当蛋清滤液pH值为9时，溶菌酶比活力最高（16048.71U/mg），当pH值过高或过低时，酶的比活力都会有所降低，可能由于pH值改变了蛋清滤液中酶的带电状态，过酸、过碱都会对酶结构造成不可逆的破坏，使酶的比活力下降。与酶含量达到最高点相比（pH8），pH9时酶含量下降，而比活力却升高，即阳离子交换法提纯蛋清溶菌酶的选择pH值为9做后续试验。

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