稳定同位素法测定大豆水溶性蛋白质中碳、氮、氧、氢稳定同位素比值及其在产地溯源鉴定中的应用（一）

大豆及其制品是我国人民膳食结构中重要的组成部分，其富含植物蛋白质、微量元素和多种维生素等成分，具有较高的营养价值。大豆榨油后产生的豆粕也是我国养殖业畜禽饲料的重要来源。然而当前我国本土生产的大豆产量已经不能满足国内市场的需要，每年都要进口大量大豆以填补国内市场的缺口。特别是近两年，中国大豆进口量稳居世界第一，2019年我国进口大豆8851万吨，2020年全年累计进口大豆10032.82万吨，同比增幅为11.7%。我国进口大豆的主要国家是巴西、阿根廷、美国和加拿大等国。2017年，我国进口大豆总量的53.3%来自巴西，34.4%来自美国。2018年4月中美爆发了贸易争端，我国开始对进口来自美国的大豆等农产品征收25%的关税，惩罚与制裁美国来源的大豆等农产品贸易商。受到中美贸易摩擦影响，我国进口大豆来源发生剧烈变化，2018年我国进口大豆中巴西大豆占进口大豆总量的75.1%，美国大豆占比下降至18.9%。美国产大豆是否通过第三国逃避关税制裁进入我国，对进入我国的大豆的产地溯源问题就变得尤其重要。

氢、氧、碳、氮、硫等稳定同位素比值具有强大溯源、示踪能力，近30年来，稳定同位素分析技术已在食品、考古、环境等领域取得了长足发展和应用，特别是在食品的真假、掺伪和产地溯源方面，如葡萄酒、饮料、蜂蜜、咖啡等成功应用解决了部分棘手的食品真假及产地溯源问题。在大豆及其制品的掺伪、产地溯源等领域，近年来也有部分学者进行了研究。而利用元素分析–同位素比质谱仪（EA–IRMS）技术，测定大豆水溶性蛋白质的内源性稳定同位素δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O和δ²H值来进行进口大豆的产地溯源尚未见文献报道。

笔者利用IRMS技术测定大豆水溶性蛋白质的内源性稳定同位素δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O和δ²H值，并结合数学统计学方法，研究探讨了大豆产地溯源鉴别方法，构建了识别准确率高的大豆产地溯源鉴定模型。可为我国海关对特定贸易国实施特殊关税措施提供有力的技术支撑，有效防止和打击特定国家的大豆通过第三国转运出口至我国的非法行为，从而维护国家利益。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

稳定同位素比质谱仪：DeltaV型，美国赛默飞世尔科技公司。真空冷冻干燥机：Alpha1–2LDPLUS型，德国Christ公司。粉碎机：JL064型，上海嘉定粮油有限公司。超纯水仪：Milli-QElix-advantageA10型，美国密理博公司。超声仪：SW30H型，瑞士SONOSWISS公司。高速冷冻离心机：SIGMA3–30KS型，德国西格玛离心机公司。电子分析天平：SartoriusBT223S型，分度值为0.001g，德国赛多利斯公司。He气（载气）、CO₂标准参考气、CO标准参考气、H₂标准参考气、N₂标准参考气：纯度（体积分数）均大于99.9995%，空气化工产品(中国)投资有限公司。超滤离心管：3K，美国密理博公司。EA–IRMS用碳、氮同位素标准物质：IAEA–600咖啡因（δ¹³C=–27.771‰，δ¹⁵N=1.00‰，分别以V-PDB和空气中的N为基准），天津欧捷科技有限公司。EA–IRMS用氢、氧同位素标准物质：EMA–P1聚酰胺（δ²H=–25.3‰，δ¹⁸O=20.99‰，以V-SMOW为基准），英国ElementalMicroanalysis公司。大豆样品：100份，分别产自阿根廷（ARG）、美国（USA）、加拿大（CAN）和巴西（BRA）。实验用水为超纯水，电阻率为18.2MΩ·cm。

1.2 样品处理

加入10mL超纯水，超声30min提取水溶性蛋白质，以10000r/min转速离心5min，取1mL上清液加入3K超滤离心管中，离心分别获得相对分子质量大于3kDa的蛋白质，转移至进样瓶中，冷冻干燥8h以上至全干，获得固态蛋白质粉末。

1.3 EA–IRMS检测方法

用锡杯和银杯分别包裹1.2中的固态蛋白质粉末，校正EA–IRMS，分开检测样品中稳定碳和氮同位素比，以及稳定氢和氧同位素比。锡杯包裹的样品引入元素分析仪的980℃高温燃烧炉，获得CO₂和N2气体，进入稳定同位素比质谱仪主机检测样品中δ¹⁵N和δ¹³C值；银杯包裹的样品引入元素分析仪的1380℃高温裂解炉中，获得CO和H₂气体，导入稳定同位素比质谱主机进行检测样品中δ²H和δ¹⁸O值。

1.4 同位素比数值校正

样品测定时，每个样品的分析起始阶段通入高纯CO、H₂、N₂和CO₂作为参考气体，然后用已知δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O和δ²H值的标准物质标定参考气体的δ值，再以参考气体的标定δ值为标准，校正样品中的δ值。数据处理及分析均通过Isodat3.0软件（美国赛默飞世尔公司)进行。δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O和δ²H的计算以δ¹³C为例，大豆水溶性蛋白中δ¹³C的计算是基于国际标准物质美国白垩纪皮狄组层位中的拟箭石化石（V-PDB），按式(1)计算：

式中：R—同位素¹³C与¹²C的比率；

R_V-PDB=0.0112372。

1.5 数据统计分析

将样品中水溶性蛋白质中的δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O和δ²H值归纳整理成excel表格，导入SIMCA14.1软件(瑞典Umetrics公司)中，进行主成分分析（PCA）与正交偏最小二乘法判别分析（OPLS–DA），获得不同产地大豆同位素分布规律，从而构建大豆产地溯源的同位素鉴别模型。

相关链接：聚酰胺，咖啡因，氮同位素，氮

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