（3）除蛋白质中离心时间的优化

本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5体积，在16000×g的离心力下分别离心10min、20min、30min、40min，选取最优化离心时间，如图4所示。离心的时间选取30～40min为最佳。

3、乙醇沉淀多糖条件的优化

（1）乙醇沉淀多糖中乙醇浓度的优化

本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5体积，在16000×g的离心力下分别离心40min，加入3倍体积浓度分别为70%、80%、95%、100%的乙醇溶液，4℃条件下醇沉12h。透析，测定胞外多糖的产量，如图5所示。多糖的提取量随着乙醇浓度的增加而不断增大。一些小分子的多糖分子在低浓度的乙醇下不易沉淀，只有当乙醇浓度足够高时，才发生沉淀。因此当乙醇浓度为100%时，达到最大值，即乙醇沉淀多糖的最优浓度为100%。

（2）乙醇沉淀多糖中乙醇体积的优化

蛋白沉淀后分别按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的料醇比加入浓度为100%的乙醇溶液，测定胞外多糖的产量，如图6所示。增加乙醇添加体积可以提高胞外多糖的获得量，沉淀中多糖提取率随乙醇添加倍数的增加而升高，但是当乙醇添加倍数在3～4倍时，EPS含量明显提高，且都达到较高浓度，所以从提取成本考虑，最佳的乙醇添加倍数为3倍。

（3）乙醇沉淀多糖中沉淀时间的优化

乙醇沉淀多糖中在4℃条件下分别醇沉12h、24h、36h，测定胞外多糖的产量，如图7所示。醇沉时间与胞外多糖含量的关系不明显。而实验过程中，加入乙醇后立即产生沉淀，并且随着醇沉时间的增加，沉淀物颜色不断加深。为了保证粗多糖的纯度，醇沉时间选12h最宜。

4、正交实验分析

分别选取影响EPS含量较大的提取条件，三氯乙酸浓度、离心力和离心时间进行三因素三水平正交实验，结果如表1。结果表明，影响EPS含量的各因素主次关系为B＞C＞A，离心力对多糖提取的影响较大，离心时间次之，三氯乙酸浓度对多糖提取的影响最小。根据正交实验结果，得出最优发酵条件组合为A₃B₂C₃，即60%的三氯乙酸浓度、在14000×g的离心力下离心40min。研究表明，离心力和离心时间的增加可以提高蛋白的脱离率，但会减少最终EPS含量，降低多糖提纯得率，因此，在14000×g离心力下离心40min最佳，EPS含量可达到392.50mg/L。

三、结论

本项目以筛选出的胞外多糖高产菌乳酸乳球菌乳亚种LL9为菌种，进行EPS提取纯化工艺条件研究。使用三氯乙酸法沉淀蛋白质，通过适当控制三氯乙酸的用量来降低对EPS结构的破坏。通过单因素实验及正交实验最终验证，发现当用浓度为60%三氯乙酸处理过发酵液后，在14000×g离心力下离心40min除蛋白效果最佳；沉淀多糖的最优组合是3倍体积、浓度为100%的乙醇沉淀12h。最优化分离纯化工艺条件为：添加三氯乙酸60%（w/v）（12h）→500r/min搅拌5min→离心沉淀除蛋白（4℃，14000×g，40min）→上清加乙醇沉淀多糖（100%，3倍体积，4℃，处理12h）→离心（12000×g，30min）→冷冻干燥→沉淀温水溶解（稀释10倍）→透析MD34（4℃，处理12h）。经实验验证工艺流程合理并可行。EPS含量最后达到392.50mg/L，产量为原来的1.49倍。为今后进一步纯化和深入研究乳酸菌产胞外多糖的结构和生物活性等提供参考。

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