点击化学在食品安全检测中的应用研究进展（三）

3.3 真菌毒素检测

真菌毒素如黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等极易污染粮食、谷物、咖啡、啤酒和茶叶等,对动物和人具有致畸、致癌、致突变和免疫抑制等毒性作用。当前,对AFB1、OTA、ZEN等的检测以传统的仪器分析法为主,如高效液相色谱法、薄层色谱等。这类方法灵敏度高且准确性好,但存在样品前处理复杂、需要专业操作人员和设备昂贵等不足,限制了其在基层的推广使用。因此,开发低成本快速检测抗生素的方法作为大型精密仪器分析法的有力补充显得尤为重要。

Qiu等分别制备了叠氮基-OTA适配体修饰的磁珠(N3-OTA适配体-MBs,DNA1)和蔗糖转化酶功能化的炔基-DNA偶联物(炔基DNA-蔗糖转化酶,DNA2),以个人血糖仪(Personal glucose meter,PGM)作为信号读出器建立了微量OTA(72 pg/mL)的检测方法。DNA1与DNA2间发生CuAAC反应形成双链的dsDNA,存在OTA时,OTA与其适配体结合,使得dsDNA双链解开,经磁珠分离后上清液中的DNA2量增多,PGM信号变强,从而实现对OTA的高灵敏检测。

Xu等通过光引发多面体低聚倍半硅氧烷(Polyhedral oligomeric silsesquioxane,POSS) 单体聚合形成含活性烯基的刚性骨架,并在70 ℃下引发巯基化的玉米烯酮适体(SH-ZEN适体)和烯基间的“巯-烯点击化学”,得到被极性适体致密包被的亲和整体柱,最终与HPLC联用对大米中的ZEN进行检测,实验结果准确可靠。Chen等基于自由基聚合和“硫醇-烯”点击反应,采用“一锅法”直接制备了一种新型的基于OTA适体的含POSS杂合亲和性整体柱,并用于啤酒样品中OTA的检测,该法特异性好且能够检测痕量OTA。

3.4 重金属检测

微量金属如铜、铁等是人体生长发育的必需元素,但摄入过量或者不足以及不平衡均会引起人体生理异常或发生疾病。此外,环境中的重金属如汞、镉等也会影响人体健康。因此,开发金属残留的高灵敏检测方法极为重要。

荧光共振能量转移(FRET)技术具有灵敏度高、反应速度快等优势,常作为反应信号放大手段用于分析检测。氧化石墨烯(GO)是一种理想的能量受体,可与许多物质发生FRET猝灭其荧光。Zheng等利用炔基修饰的氧化石墨烯(GO-C2)和叠氮基修饰的罗丹明100(Rho-N3)间发生CuAAC反应导致Rho-N3的荧光被显著猝灭的机理,实现了Cu2+的高灵敏检测。该方法可以高效快速(1 min)地检测尿液中的Cu2+,为临床诊断提供了一定的理论基础(图2A)。

在AuNPs的局部表面等离子体激元共振(LSPR)和CuAAC反应高特异性的基础上,Zhou等通过配体交换反应制备了叠氮基和炔基修饰的AuNPs,利用CuAAC反应使两种AuNPs交联并引发聚集使体系溶液从红色变为蓝色,进而通过肉眼对Cu2+进行了定性检测。Carol等通过二炔交联剂诱导叠氮基修饰的AuNPs聚集实现了Cu2+的灵敏检测,检测限低至1.8 μmol/L。AuNPs易在高浓度盐溶液中发生聚集,导致颜色由红变蓝,但是谷胱甘肽存在时则会抑制这一现象。

除CuAAC反应外,光或热引发的“巯-烯”点击化学也常应用于材料修饰中。Zuo等通过光引发的“巯-烯点击化学”合成咪唑官能化聚硅氧烷(PMMS-IM),该材料在365 nm处表现出强烈荧光。过渡金属离子Fe3+等能够与富电子基团发生配位结合而引起荧光猝灭,故作者将PMMS-IM用作Fe3+的荧光检测探针,并用于检测Hela细胞中Fe3+的原位循环。

脱氧核酶(DNAzyme)是在体外筛选、扩增获得的一种具有催化功能的DNA片段,可形成G-四链体并结合血红素,适用于小分子、金属离子、DNA等的检测。Li等结合Cu+催化的点击化学和Mg2+依赖性DNAzyme循环扩增的策略,开发了一种可灵敏检测人血清中Cu2+的比色传感法,该方法的线性范围为5～500 nmol/L,检测限低至2 nmol/L(图2B)。

CuAAC反应生成的三唑环在检测体系中具有极大的作用:(1)作为与目标分析物的结合位点;(2)作为离子载体与荧光团之间的连接基团。Hou等利用CuAAC反应合成了含有两个三唑环的新型二甲苯苯基环烷烃1,其在292 nm激发波长处具有强荧光。在甲醇溶液中,该环烷烃1的三唑环能特异性地结合Ag+,同时,由于螯合增强荧光猝灭(CHEQ)效应,使得环烷烃1的荧光被显著猝灭,从而可实现对Ag+的检测。Zhang等利用Cu+触发UiO-66-N3与苯乙炔的点击反应,合成了一种新型金属有机骨架(MOF)荧光探针UiO-66-PSM,该探针的三唑环可以与Hg2+配位结合猝灭UiO-66-PSM的荧光,较其他金属离子表现出更明显的荧光响应,且在水溶液中有很好的稳定性,可用于环境水体中Hg2+的检测。

Fomo等基于叠氮基苯胺盐酸盐与炔烃封端的金属钛氰(MPc)的CuAAC反应,制备了一种新型低对称炔末端钴——酞菁钴(CoPc)。将该CoPc经差动脉冲溶出伏安法(DPSV)修饰于玻碳电极上,可同时检测Hg2+、Cu+、Pb2+、Cd2+和As3+等金属离子。

3.5 食源性致病菌

食源性疾病是全球最突出的公共卫生问题之一,随着食品供应链的快速发展,食源性疾病在全球各地的蔓延不仅危害人体健康,还会造成严重的经济问题。目前食源性致病菌的检测手段主要是传统的选择性平板培养和凝集实验等,以上方法存在操作繁琐、检测周期长等缺点,不能满足食源性致病菌快速检测的迫切需求。

Huang等开发了一种无酶生物传感器用于快速(1 h内)检测沙门氏菌。研究者首先制备了姜黄素-牛血清白蛋白纳米颗粒(CUR-BSA),通过反式环辛烯(Tz)-1,2,4,5-四嗪(TCO)间的无铜点击化学反应形成Tz-TCO-CUR复合物后将其进行抗体功能化,并结合磁分离技术对沙门氏菌进行定性和定量检测,方法检测限低至50 CFU/mL。

此外,Guo等综合旋转磁分离法、金纳米管(GNR)指示法以及Tz-TCO点击化学信号放大法,建立了一种检测鼠伤寒沙门氏菌的比色免疫传感器。该免疫传感器检测时间为3 h,线性范围为101～105 CFU/mL,检出限为35 CFU/mL。

大肠杆菌(E.coli)能够特异性地捕获环境中的Cu2+将其还原为Cu+,Mou等基于此并利用叠氮-AuNPs和炔烃-AuNPs的CuAAC反应,实现了对大肠杆菌的快速灵敏检测。当存在E.coli时,外源性Cu2+被E.coli还原为Cu+而触发CuAAC反应,导致金纳米颗粒聚集并使体系由红色变为蓝色,仅用肉眼即可快速轻松地实现病原菌的检测。

4 结论与展望

作为一类新型的合成反应,点击化学由于其生物相容性和环境友好性等优势被大量研究,并在诸多领域得到广泛应用。值得注意的是,将免疫分析法和点击化学反应有效结合,能够实现分析物更加快速灵敏的检测,例如,利用基因工程技术制备抗体与反应底物催化酶的融合蛋白用于替代传统免疫分析法中的一抗和酶标二抗,能够减少孵育反应次数和洗涤次数,极大地缩短检测时间,同时避免了过多孵育和洗涤次数对灵敏度的影响。当前,点击化学在食品安全检测领域的应用研究尚处于初期阶段,尽管已取得了较好的研究进展,但现阶段点击化学自身存在的局限性仍需引起研究人员的重视。如:(1)点击化学的发生需要特定的反应基团参与,而在纳米材料上修饰反应基团则操作繁琐费时;(2)点击化学反应类型较少,已报道的点击化学反应大部分都是叠氮化物与端基炔的1,3-偶极环加成反应和巯基-烯加成反应;(3)需要加入过量的铜盐使点击化学反应完全,提高了反应成本;(4)叠氮化合物危险性高、毒性强,严重威胁研究人员的生命健康。因此,针对上述问题,亟需开发出更为经济、绿色、安全的点击化学反应类型,使点击化学在食品安全检测领域得到更为深入的研究,同时有助于拓宽点击化学在其他研究方向的应用。

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