复方中草药对肉鸡生长性能及天然免疫相关基因mRNA表达的影响（一）

近年来，肉鸡养殖中抗生素的滥用导致致病菌的耐药性越来越强，兽药残留造成鸡肉食品安全问题受到消费者的密切关注，随着2020年无抗禁令的实施，我国肉鸡养殖进入无抗养殖时代，替抗产品的研究成为新的热点，中草药制剂、酶制剂、微生态制剂、植物精油等均被认为是潜在的替抗产品。中草药作为一种绿色添加剂广泛应用于畜牧养殖业，其生物活性物质能够促进动物健康生长，使畜禽机体内环境保持平衡状态。而且中草药具有毒副作用小、促进生长、促进动物新陈代谢、无耐药性、提高饲料报酬、预防疾病等优点，它克服了化学合成药物毒副作用大的缺点，是新一代安全性能较好的饲料添加剂。

中草药应用于家禽已被国内外学者进行了大量研究，多数研究结果表明，在饲粮中添加不同配方的复方中草药，可以提高肉鸡的生长性能、免疫功能以及肉品质，同样促进育肥猪的增重速度并改善肉品质。但是中草药具有配伍不相容、用量大、作为添加剂使用缺乏统一的质量检验标准等缺点，复方中草药调节机体免疫功能的作用机制认识尚不清楚，还需进一步研究和探讨。本试验旨在评估复方中草药对肉鸡生长性能、免疫器官发育指数及天然免疫相关基因mRNA表达的影响，为复方中草药在家禽生产中的应用以及替代抗生素的可行性提供参考。

1.材料与方法

1.1试验材料

试验用复方中草药由兰州威特森生物科技有限公司提供，主要成分为女贞子、板蓝根、当归、柴胡、丹参、黄芪。肉鸡为科宝505白羽肉鸡，购自陕西宝鸡大成禽业有限公司。RNA提取试剂盒购自美国纽英伦生物技术公司（NEB），SYBRqPCRSuperMIx购自近岸科技有限公司，RNA反转录试剂盒购自瑞士罗氏制药有限公司，其他化学试剂均购自美国SIGMA生物科技有限公司。

1.2试验设计

本试验采用单因素完全随机设计，选择1日龄健康‘白羽肉鸡’504只，按照组平均体质量相近原则分为7组，每组6个重复，每个重复12只鸡，公母各半，分别饲喂基础饲粮（对照组，A组）、基础饲粮＋抗生素（0.48G/kg氟苯尼考，1～42d，B组）、基础饲粮＋100mL/kg复方中药制剂提取物（C组，14～42d）、基础饲粮＋100mL/kg复方中药制剂提取物（d组，21～42d）、基础饲粮＋100G/kg复方中药粉末制剂（E组，14～42d）、基础饲粮＋100G/kg复方中药粉末制剂（F组，21～42d）、基础饲粮＋20G/kg复方中药粉末制剂（G组，14～42d）。饲养期为42d，分前期（0～21d）和后期（22～42d）2期进行。

1.3试验饲粮

基础饲粮组成见表1，营养参数参考农业行业标准NY/T33-2004配制。配方计算时，原料中干物质、粗蛋白、粗脂肪、有机物、钙和总磷的含量均采用实测值，其他指标参考中国饲料成分及营养价值表（2017年第28版）。试验提供粉料饲喂肉鸡。

1.4饲养管理

试验肉鸡饲养管理参照《科宝肉鸡饲养管理手册》。采用3层立体叠笼饲养，自由采食和饮水，日饲喂3次。试验期内保持鸡舍内正常通风，按常规免疫程序进行免疫，每日巡栏观察鸡群精神状态和采食情况，早晚各消毒1次，保持鸡舍内外空气清洁卫生。

1.5样品采集

1.5.1血液样品采集

分别于21、28、35、42d以重复为单位，在A组和d组中每笼抽取与平均体质量接近的2只鸡（公母各1只）采集翅下静脉全血，混合后-20℃保存，饲养试验结束后带回实验室用于细胞因子的检测。

1.5.2免疫器官的采集

42日龄，以重复为单位每笼抽取与平均体质量接近的2只鸡（公母各1只），称其活质量，屠宰解剖后立即分离胸腺、脾脏、法氏囊，用滤纸吸去血渍，剔除脂肪组织后称鲜质量，并计算免疫器官指数。

1.6.2细胞因子测定

以βactIn基因作为内参基因，实时荧光定量测定肉鸡血液中IL-2、IL-6、IL-8、IL-100、TLR-3、TLR-3基因的mRNA相对表达量。

1.6.2.1全血RNA的提取及CdNA的合成

将带回实验室的血样解冻后立即提取全血RNA并进行反转录，具体步骤依照QuICkRNATMWHolEBloodCATAloGNos。R1201试剂盒及反转录试剂盒说明进行。

1.6.2.2引物的合成

根据GENBANk数据库中IL-2、IL-6、IL-8、IL-100、TLR-3、TLR-4和β-actIn的基因序列，利用pRIMER5软件设计引物，详细序列信息见表2，所有引物序列均由武汉金开瑞生物工程有限公司进行合成。

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