分离技术在新型冠状病毒研究和防疫检测中的应用（三）

发布时间：2021-06-04 12:05 编辑者：特邀作者余秀梅

2 液相色谱

高效液相色谱(HPLC)具有高效、快速、灵敏度高、重复性好等特点，是化合物纯度鉴定和生物大分子分析的通用分析方法。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)在保留色谱技术高效分离优势的同时，通过MS获得待测组分丰富的结构信息，在药物代谢、复杂基质单一成分鉴定、代谢组学研究等方面凸显优势。

2.1 新型冠状病毒候选药物评估

Zhang等报告了冠状病毒药物靶标Mpro与α-酮酰胺抑制剂复合物的X射线结构，通过LC-MS/MS分析确定α-酮酰胺抑制剂13a和13b具有明显的肺向性。Jin等利用计算机辅助药物设计筛选Mpro抑制剂，测定了 10 000 多种药物或活性化合物，并利用LC-MS/MS分析确定依布硒啉、PX-12和卡莫呋对Mpro的共价结合。Ma等将非变性质谱(native MS)用于Mpro与4种潜在抑制剂(波普瑞韦、GC-376以及钙蛋白酶抑制剂II和XII)的结合表征，结果发现此4种化合物均能明显抑制SARS-CoV-2在细胞内复制。Maisonnasse等基于LC-MS/MS研究了羟氯喹(HCQ)在体外和SARS-CoV-2感染猕猴中的抗病毒活性，通过定量分析血清、血液以及肺组织中HCQ含量，发现HCQ没有明显的预防感染能力。

2.2 复杂基质单一成分鉴定

Dai研究组针对SARS-CoV-2主要蛋白酶Mpro设计合成了两种先导化合物11a和11b, 通过HPLC鉴定其纯度，分别为99.88%和99.20%,这两种化合物在体内均表现出有效的抗SARS-CoV-2感染活性，可作为候选药物用于后续临床研究。Monteil等使用HPLC鉴定了鼠源重组ACE2,并比较了鼠源重组与人重组ACE2在SARS-CoV-2抗感染方面的差异。结果表明，人重组ACE2可显著降低细胞和多种人体器官模型的病毒感染，而鼠源重组ACE2则没有此效果。在对患病程度不同的新冠病人及健康人员血清进行蛋白质组学和代谢组学分析后，Shen等利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)从血清中分离鉴定并定量了894种蛋白质和941种代谢物(包括36种药物及其代谢物),揭示了重症患者血清中特征蛋白质和代谢产物的变化，为疾病严重程度评估提供参考。

3 磁珠分离

磁珠分离技术可通过磁性颗粒表面修饰的官能团或特异性抗体，从复杂基质中选择性结合靶标分子，并在外磁场辅助下实现目标物富集，其分离效率高、重复性好，但提取效率低且价格较高。当前，磁珠分离技术仍是新型冠状病毒分离的主要方法，且有多款基于磁微粒-化学发光的检测试剂盒通过国家药监局审批。该试剂盒采用双抗原夹心原理，形成化学发光剂/抗原-抗体-磁颗粒/抗原复合物，在磁场辅助下分离结合状态和游离状态的化学发光剂标记物，随后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性分析。磁珠分离技术还能与病毒核酸自动化提取设备配套使用，对大批量样本的核酸进行提取，方法操作简单，极大节约了时间和人工成本，可显著提高核酸的检测效率。

在新型冠状病毒研究中，磁珠分离技术主要应用于细胞分离、核酸提取和免疫学检测。Cao等利用免疫磁珠从外周血单核细胞(PBMC)中负选分离到B细胞，并用结合肿瘤坏死因子受体超家族7(CD27)抗体的磁珠进一步分离得到CD27+记忆B细胞，通过高通量单B细胞测序对新冠康复期患者体内中和抗体进行鉴定。Zhao等在磁性纳米颗粒上涂覆了一层聚(氨基酯)-羧基，利用核酸与羧基之间强相互作用提取SARS-CoV-2的RNA。该方法将病毒遗传物质裂解、提取和结合步骤组合到一起，得到的纳米颗粒-RNA复合物不需要额外洗脱即可引入后续的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),极大提高COVID-19的诊断效率。Fabiani研究组以磁珠为免疫载体，碱性磷酸酶为免疫标记二抗，开发了一种唾液中SARS-CoV-2快速检测的电化学免疫分析法。所建方法可用于唾液临床样本中S蛋白和核衣壳蛋白(N蛋白)的检测，检出限分别为19 ng/mL 和8 ng/mL。

4 离心

离心技术操作简易，成本较低，是通过控制离心机转速实现样品中蛋白质、核酸及细胞亚组分的分离。作为最基础的分离技术，离心技术在新型冠状病毒检测中可用来分离血浆中的血清，用于抗体和抗原的检测。在新型冠状病毒实验室研究环节，通过离心技术可分离鼻咽拭子中颗粒物质以及未消化的死细胞和纤维碎片，并反复离心清洗来沉淀纯化病毒核酸。相比于普通离心技术，超速离心技术具有更强的离心力场，可迅速实现小颗粒(如病毒颗粒、蛋白质等)的沉降分离。Bao等使用超速离心从Vero E6病变细胞中沉淀获得病毒颗粒，研究了SARS-CoV-2在表达人ACE2转基因小鼠中的致病性。Zost等将超速离心用于S蛋白假型慢病毒的分离，来测定两种单克隆抗体的中和能力，结果显示假病毒比野生型病毒具有更敏感的中和表型，证明在单克隆抗体效果测定中使用活病毒的必要性。此外，聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度梯度离心技术也被用于分离PBMC,以研究普通冠状病毒和SARS-CoV-2的免疫学差异。

5 微纳分离

材料科学和电子技术的进步带动了微纳分离技术发展，使其成为生物样品分析的重要技术手段。微流控技术具有微型尺寸、样品量小、快速扩散、比表面积大等优势，常与其他技术结合，用于SARS-CoV-2相关蛋白质的高灵敏检测。Lin等开发了一种微流控免疫芯片，结合自制荧光检测器分析检测了SARS-CoV-2 3种生物标志物(IgG、IgM和抗原)。该方法快速、灵敏、便捷，在15 min内即可完成SARS-CoV-2检测。Xiong研究组基于环介导等温扩增技术(LAMP),开发了一种便携式LAMP-微流控集成系统，该系统使用小型圆盘状微流控芯片(81 mm),可在40 min内同时识别7种已知人类冠状病毒。Funari等将电沉积方法用于一种光微流体传感平台开发，通过比较金纳米钉在抗原-抗体结合时局部折射率变化，在30 min内实现1 μL血清样品中SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体测定，检出限低至0.08 μg/L(～ 0.5 pmol/L)。Tan研究组提出了一种便携式化学发光微流体的酶联免疫吸附测定(ELISA)技术，从候选蛋白质中筛选出对SARS-CoV-2 S1蛋白具有高亲和力和特异性的D006作为校准抗体，在15 min内可对血清中低至2 ng/mL 的S1特异性IgG进行定量评估。此技术还被用于S1和N蛋白的高灵敏检测(40 min),检出限分别为4 pg/mL 和62 pg/mL。Lakshmanan等将微流控芯片技术用于体外抗凝治疗的止血效果评估，设计了一种具有两条正交通道的微流控装置，其中一条通道作为血管模型，另一条通道用来模拟损伤部位止血塞的形成，用于识别潜在的抗凝靶点和试验药物，以此减轻COVID-19相关的血栓并发症。

6 电泳

电泳技术利用带电粒子在电场中移动速率不同而达到分离的技术，是生命分析领域重要分离手段之一。然而，在新型冠状病毒研究中电泳的许多应用均可被分子生物学方法替代，且在实际检测中相比于自动化设备和商品化试剂盒，其技术要求高，因而应用有限，亟待后续研究拓展。其中，琼脂糖凝胶电泳(AGE)是应用较多的电泳技术，常被用于聚合酶链式反应(PCR)产物分析。Kim等对SARS-CoV-2的RNA基因组结构进行了解析，并用AGE方法验证了测序发现的亚基因组RNA(sgRNAs),进而揭示基因在RNA基因组上的确切位置。Meza-Robles等提出一步嵌套式RT-PCR,不需要实时热循环仪，通过AGE即可实现新型冠状病毒的定量检测。该技术使用4个物种特异性的诊断引物，可同时实现特定区域扩增和阳性对照。Si等对 2 188 例疑似COVID-19患者的鼻咽拭子样本进行分析，使用RT-PCR检测SARS-CoV-2, PCR片段分析结合毛细管电泳检测12种病毒，以研究SARS-CoV-2和常见呼吸道病毒的流行病学规律，以此提高疑似COVID-19患者的诊断效率。

7 结论

新型冠状病毒研究已取得一定进展，分离技术在其中发挥着重要作用。其中，AC和SEC广泛用于病毒相关蛋白质纯化中；精密仪器制造业的发展，促使HPLC分离效率的提升，是完成高灵敏度、快速解决病毒代谢组学分析的关键手段；新材料和电子技术的进步，带动磁珠和微纳分离技术的灵敏度提升和应用范围拓展，尤其是对化学试剂消耗降低，实现了对环境的友好，是解决细胞分析、核酸分离和免疫学检测的首选技术；传统的离心技术在病毒颗粒和细胞分离中发挥着不可替代的作用；电泳技术主要用于PCR产物分析。

当前，新型冠状病毒检测的难点主要集中在“假阳性”和“假阴性”结果上。作为新型冠状病毒检测的“金标准”,核酸检测能检测出处于窗口期的患者，但病毒载量差异、样品采集、诊断试剂质量、实验操作等问题会导致“假阴性”结果；抗体检测操作简单快捷，可作为核酸检测假阴性的有效补充，但其对灵敏度和特异性要求高，灵敏度低会产生“假阴性”结果，特异性低则会产生“假阳性”结果。分离技术作为新型冠状病毒检测的关键技术，可分离纯化复杂基质中病毒颗粒、核酸和蛋白质，减少基质中干扰物质带来的“假阳性”结果；同时，分离技术与新型检测技术结合，可进一步提高病毒相关蛋白质检测的灵敏性和特异性，确保检测结果准确可靠。

综上所述，分离技术在新型冠状病毒研究和防疫检测中应用广泛。这些分离技术各具特色，根据实验需要选用合适的分离技术，灵活组合，能有效推动新型冠状病毒检测、疫苗和创新疗法的研发，使疫情早日得到控制。