黑木耳胞外多糖对小鼠肠道微生态及免疫调节的影响(二)

2结果与分析

2.1黑木耳胞外多糖红外光谱鉴定

每升黑木耳发酵液能提取多糖244mg，纯度为85.3%，FＴ-IR光谱显示，黑木耳胞外多糖为具有典型β-吡喃糖结构的复杂多糖（图1），官能团分析表明，在3419cm^-1处的宽峰是-OH伸缩振动吸收峰，2973cm^-1和2918cm^-1处的弱吸收带是-CH伸缩振动吸收峰，1735cm^-1和1638cm^-1处的吸收峰表明含有糖醛酸，1383cm^-1是-CH弯曲振动吸收峰，1078cm^-1和1048cm^-1处的吸收峰是C-O-H和C-O-C中的C-O引起的振动吸收；880cm^-1是β-糖苷键的特征吸收峰。

2.2黑木耳胞外多糖的单糖组成分析

黑木耳胞外多糖经过酸水解和衍生化后，利用HPLC分析其单糖组成。结果显示，葡萄糖和木糖为其主要的单糖组分（物质的量比为53.85%和25.05%），还有少量的甘露糖、果糖、岩藻糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸（表1）。与红外光谱分析结果一致，黑木耳胞外多糖是由多种单糖组分构成的杂合多糖。

2.3黑木耳胞外多糖对小鼠体重及脏体比的影响

与对照组相比，灌胃黑木耳胞外多糖后小鼠体重无明显变化（图2）。脏器系数是反映动物器官发育的重要指标，可直观反映受试物对动物存在的毒害作用。本研究通过称量小鼠各脏器组织质量，计算其脏器系数。黑木耳胞外多糖对小鼠脏器系数的影响见表2，统计分析显示，样品组与对照结果无显著性差异（P＞0.05）。上述试验表明，灌胃黑木耳胞外多糖不会引起小鼠脏器发生病理性异常。

2.4黑木耳胞外多糖对小鼠肠道菌群的影响

本试验利用微生物16SrRNA基因测序技术，探索了灌胃黑木耳胞外多糖小鼠肠道菌群的变化情况。测序所得原始数据经筛选过滤后，对获得的序列进行可操作单元分析（OＴU）归并划分，采用Greengenes数据库进行注释，通过多种多变量统计学分析工具对不同样本（组）微生物群落结构差异进行分析，得到了小鼠肠道微生物16SrRNA在属水平OＴU序列的相对丰度（图3）。通过Metastats对样本组间序列量差异的比较检验发现，与对照组相比，拟杆菌属和罗氏菌属显著增加（P＜0.05），拟杆菌属在多糖组肠道微生物群中占（10.31±1.5）%，而对照组为（5.4±1.38）%；罗氏菌属在多糖组中占（0.17±0.07）%，而在对照组中未检测到。

2.5黑木耳胞外多糖对小鼠肠道短链脂肪酸含量的影响

肠道微生物通过膳食纤维的发酵和短链脂肪酸（SCFAs）的产生来提高能量利用率，从而提高宿主代谢效率。本试验将小鼠粪便样品按照冷冻干燥粪便样品，准确称取50mg样品，加入1.2mL磷酸盐缓冲液（pH7.3）混匀，4℃14000r/min离心20min，吸取上清液至5mL离心管中。每200μL上清加入0.1mL的稀释后硫酸（体积分数50%），充分混匀3min，用2mL二氯甲烷（色谱级）进行萃取，4℃静置2h，然后用0.22μm有机滤膜过滤。采用气相色谱（GC）检测样品中短链脂肪酸的含量，样品提取方法参照Zhao等并做部分修改。GC分析采用常规HP-FFAP（25m×0.32mm，0.5μm）配置柱，程序设定参照贾益群等在生物样品脂肪酸提取与分析的研究结果，并调整其分流比为20∶1。SCFA标准品溶液的配置以及标准曲线绘制参照孟拓等对气相色谱-质谱联用法分析肠道炎小鼠短链脂肪酸代谢研究结果。

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