抑制烟草青枯病的3株放线菌筛选及鉴定（一）

发布时间：2021-06-16 17:27 编辑者：特邀作者周世红

自1908年发现烟草青枯病这种典型的维管束病害以来，国内外许多学者致力于烟草青枯病的防治研究，并获得多种防治方法，其中主要包括化学防治(陈泽棚等,2011)、选育抗病烟草(Nicotianatabacum)品种防治(方树民等,2001)、通过耕作制度管理防治(万川等,2015)和生物防治等。我国针对烟草青枯病的生物防治研究起步较晚，需要加大研究力度以解决烟草种植业中面临的问题。烟草青枯病的生物防治方法主要有无致病力(avirulent-strains)青枯病原菌(Ralstoniasolanacearum)的应用(谢锐鸿等,2014；肖田等,2008；肖田等,2015)和拮抗烟草青枯病原菌的应用，以及利用其他植物的提取物进行防治等(邓正平等,2003；陈启建等,2004；刘学端,肖启明,1997；赖荣泉等,2011)。目前已有报道的拮抗烟草青枯病原菌的微生物主要种类为细菌中的芽胞杆菌属(Bacillus)(何玉安等,2018；张欣悦等,2020；刘艳霞等,2020)和假单胞菌属(Pseudo-monas)(胡军华等,2009；董夏伟等,2011)，其他种类的微生物相对较少。已有的研究表明，拮抗烟草青枯病原菌的放线菌类微生物主要是链霉菌(Strepto-myces)(罗文建等,2017；张薇,2009)。施用添加拮抗菌的有机肥对控制烟草青枯病和提高产量具有良好的效果(张欣悦等,2020；张明宇等,2020)。本研究针对四川省烟草主栽区，从凉山州和泸州市的烟草根际土壤中共分离获得3株拮抗烟草青枯病原菌的放线菌，并对其进行鉴定，以期加速烟草青枯病原菌拮抗菌应用于生物有机肥的进程，为生物有机肥研制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1供试病原菌

烟草(Nicotianatabacum)青枯病原菌(Ralstoniasolanacearum)，由云南省烟草科学研究院惠赠。烟草猝倒病原菌-瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、烟草黑胫病原菌-寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)和烟草赤星病原菌-链格孢(Alternariaalternata)，由中国农业科学院农业区划与农业资源研究所惠赠。辣椒(Capsicumannuum)青枯病原菌ZT3721由南京农业大学植物保护学院惠赠。番茄(Solanumlycopersicum)青枯病原菌GIM1.70和马铃薯(Solanumtuberosum)青枯病原菌GIM1.74购买自广东微生物菌种保藏中心。

1.2培养基

LB培养液：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，pH7.4。TM培养基：蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，酪素水解物(trypticase)1.0g，琼脂粉18.0g。

1.3拮抗菌的筛选

结合喷雾法和双层平板法初步筛选拮抗菌株(王羽,肖崇刚,2004；赵斌,何绍江,2002；Sooheeetal,2008)，复筛时将初筛所得菌株接入LB培养液中进行液体发酵，发酵液与烟草青枯病原菌进行平板对峙实验(吴翔等,2019)，在TM培养基中涂布病原菌的菌液，再用直径6mm的打孔器在培养皿中央打1个孔，在孔中接入20μL初筛拮抗菌的发酵液，记录孔周围的抑菌圈直径。抑菌圈直径反映各菌株对病原菌的抑制能力。

1.4拮抗菌抑菌谱测定

分别测定拮抗菌固体菌体和发酵液对待测病原菌的拮抗能力，测定方法为平板对峙法。用直径为6mm的打孔器先在盛有TM培养基的培养皿中央打1个孔，然后在距离平板中心相等的3个方向分别打孔。从完成培养的病原菌平皿中打孔获得同样大小菌饼，置于空白培养基的中央孔，四周孔分别接入拮抗菌菌饼和发酵液，于28℃正置培养，观测抑菌情况。

1.5菌株鉴定

1.5.1形态特征分析

显微形态特征分析：放线菌的菌丝和孢子形态用高氏一号培养基(赵斌,何绍江,2002)埋片培养。将琼脂平板挖长方形小穴，于穴边缘接种筛选出的菌株，盖上无菌盖玻片，适当温度下培养，菌体长在盖片上。第5天取出盖片，风干样品，镀膜后在JSM7500F型扫描电镜(JEOL,日本)下观察超微结构。

培养形态特征分析：参照有关放线菌培养特征所采用的标准培养基进行实验(Shirlingetal,1966)。选用以下8种培养基：察氏琼脂、葡萄糖-天门冬酰胺琼脂、麦芽膏-酵母膏琼脂、马铃薯浸汁琼脂、燕麦片琼脂、无机盐淀粉琼脂、甘油-天门冬酰胺琼脂、营养琼脂，分别在平板划线接种3株放线菌，30℃培养。在培养的第3和5天，观测气生菌丝和基内菌丝的颜色及其生长情况，观察并记录是否产生可溶性色素及其颜色。将放线菌划线接种于高氏一号培养基上，于培养箱适温、适时培养，对菌落形态拍照。

1.5.2生理生化特征分析

生长的pH范围：将高氏一号培养基的pH调节为5、6、7、8、9、10、11，将待测菌株接入培养基中，于30℃培养，观测菌株的生长情况，确定最适pH值及范围。生长温度实验：将放线菌接入高氏一号培养基，分别于7、15、25、30、40、45、50和55℃培养，于第3天和第7天观察菌株的生长状况，确定各菌株的最适生长温度及范围。NaCl耐受实验：分别在高氏一号培养基中添加1%、4%、8%和10%(W/V)NaCl，将菌株接入培养基，检测各菌株对NaCl的耐受性。其他生理生化检测参照《微生物学实验》(赵斌,何绍江,2002)进行操作。

1.5.3总DNA提取与PCR扩增

采用杭州博日科技有限公司的试剂盒进行待测菌株基因组DNA提取。用细菌通用引物对(正向引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT3')扩增菌株16SrRNA基因；以获得的DNA序列构建系统发育树(吴翔等,2019)。由上海生工生物工程有限公司合成引物并对PCR产物测序。将测得的16SrRNA基因序列提交GenBank,获得各菌株的核酸登录号。

2结果与分析

2.1拮抗菌株筛选

采用喷雾法和双层平板法初筛拮抗菌株，以能产生明显的拮抗圈为特征进行筛选，初步筛选出对烟草青枯病原菌具有拮抗作用的放线菌6株(图1A)。利用平板对峙法再从初筛的菌株中复筛，结果显示，其中3株放线菌(SC-105-B-10,L2-003-A-5,SC-168-A-2)的发酵液在培养基上的抑菌圈明显，抑菌圈直径分别为30.67、17.03和30.33mm(图1B)。