同位素稀释气相色谱-串联质谱法测定动物源食品中克霉唑残留量（一）

克霉唑为咪唑类广谱抗真芮药，是治疗真荫感染疾病的合成抗菌药，对多种真菌尤其是白色念珠菌具有较好的抗菌作用。克霉唑属于第二代咪唑类的抗真菌药，1981年和咪康哗、酮康哗、益康哗等抗真菌药在美国上市。美国食品和药品监督管理局(FDA)目前只批准了哗类、嘧啶类和多烯类等抗真菌药用于人体的全身性真菌治疗。目前已发现大多数抗真菌药具有细胞毒性较强的问题。因此有必要加强对动物源食品中克霉唑残留量的检测。

目前国内外对克霉唑的测定主要集中在药品方面，采用的方法多为高效液相色谱法。关于环境和食品克霉唑测定研究较少，Assress等采用了UHPLC-QTOF-MS对污水中克霉唑在内的哗类杀菌剂进行目标定量及其他新兴污染物的筛选，张凯等采用UPLC-MS/MS法测定了羊肉中克霉哗在内的8种抗真菌药含黄。加速溶剂提取(ASE)具有提取效率高、所用溶剂少、重现性好等优点，气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)将色谱高效的分离效能和质潜的高灵敏度、强抗十扰的临测能力相结合，实现了在复杂基质背景下对目标物的准确测定。有关动物源食品中克霉唑残留的GC-MS/MS测定国内外尚未见报道。本文以环己烷/乙酸乙酯为提取溶剂，加速溶剂提取动物源食品中残留的克霉唑，提取液经凝胶渗透色谱净化后进行GC-MS/MS分析，同位素内标法定量，该方法能够满足动物源食品中克霉唑残留最的确证和定苗分析。

1材料与方法

1.1材料与仪器

猪肉、鸡肉、猪脂肪、猪心、猪肝、猪肾样品市售；克霉哗标准品(CASN0.23593-75-1，99.9％纯度)德国Dr.EhrenstorferCml)H；克霉唑-d5(99.0％纯度)加拿大CDN公司；色谱纯乙腈、正己烷和乙酸乙酯德国Merck公司。
Milli-QAdvantageA10超纯水系统：美国Millipore公司；STl6R离心机：美国Thermo公司；GM300组织捣碎机：德国莱驰公司；MS105DU电子天平、PL203电子天平：梅特勒公司；T18型均质器德国IKA公司；DionexASE350加速溶剂提取仪：美国Dionex公司；GPCVario凝胶渗透色潜仪：德国LC-Tech公司；ThermoFisherTrace1300-TSQ8000三重四极杆气相色潜-质谱联用仪：美国Therrno公司。

1.2实验方法

1.2.1标准溶液配制

取克霉唑标准品10mg，用乙腈溶解并转移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉唑标准储备液；取克霉哗-d₅标准品1mg，用乙腈溶解并转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉哗-d₅标准储备液。用乙腈稀释配制浓度分别为1、2、5、20、50、100μg/L的系列标准工作溶液，其巾克霉哗-d₅同位素内标溶液浓度均为20μg/L。

1.2.2试样制备

取有代表性猪肉、鸡肉、猪脂肪、猪心、猪肝、猪肾样品样品各500g，将其切碎后，用组织捣碎机将样品加工成浆状，混匀，装入洁净的盛样容器内，密封并标明标记。

1.2.3加速溶剂(ASE)提取

称取3.0g制备好的样品并转移至陶瓷研钵中，加入60μL、浓度为1.0μg/mL的克霉唑-d₅标准溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，转移研磨好的样品于10mL的提取池中，进行加速溶剂(ASE)提取，提取条件为：提取溶剂为环己烷和乙酸乙酯，体积比为1:1，提取温度100℃，加热并静态提取5min，对提取池体积30％的提取溶剂进行氮气吹扫60s后得到提取液。将提取液转移至50mL圆底烧瓶中，在35℃水浴中，通过旋转蒸发仪浓缩至小于3mL，转移剩余液体至10mL刻度离心管中，补加体积比为1:1的环己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待净化液，备用。

1.2.4凝胶渗透色谱(GPC)净化

凝胶渗透色谱(GPC)条件如下：净化柱：500mm×10mm，填装10gBioBeads-X3填料，柱床高32cm；流动相：体积比为1:1的环己烷和乙酸乙酯，流速为1.0mL/min；样品定量环为1mL；预淋洗体积为17mL；洗脱体积为15mL；清洗体积为5mL。称取3.0g制备好的样品并转移至陶瓷研钵中，加入60μL、浓度为1.0μg/mL的克霉唑-d₅标准溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，转移研磨好的样品于10mL的提取池中，进行加速溶剂(ASE)提取，提取条件为：提取溶剂为环己烷和乙酸乙酯，体积比为1:1，提取温度100℃，加热并静态提取5min，对提取池体积30％的提取溶剂进行氮气吹扫60s后得到提取液。将提取液转移至50mL圆底烧瓶中，在35℃水浴中，通过旋转蒸发仪浓缩至小于3mL，转移剩余液体至10mL刻度离心管中，补加体积比为1:1的环己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待净化液，备用。制备的待净化液1mL通过凝胶渗透仪按上述条件净化，收集洗脱液于刻度离心管中。

1.2.5液液分配

将收集到的洗脱液于45℃的水浴中氮气吹至近干，取0.5mL乙腈饱和的正己烷涡旋振荡溶解残余物，再加入0.5mL正己烷饱和的乙腈，涡旋振荡并静置分层，吸出乙腈层于2mL进样小瓶中，向刻度离心管中重复加入0.5mL正己烷饱和的乙腈重复操作一次，合并乙腈层，过0.22μm滤膜于GC-MS/MS的进样小瓶中，制得待测样品溶液，供GC-MS/MS测定。

1.2.6基质匹配标准溶液的配制

取有代表性猪肉、鸡肉、猪脂肪、猪心、猪肝、猪肾样品样品各500g，将其切碎后，用组织捣碎机将样品加工成浆状，混匀，装入洁净的盛样容器内，密封并标明标记。称取3.0g制备好的样品并转移至陶瓷研钵中，加入60μL、浓度为1.0μg/mL的克霉唑-d₅标准溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，转移研磨好的样品于10mL的提取池中，进行加速溶剂(ASE)提取，提取条件为：提取溶剂为环己烷和乙酸乙酯，体积比为1:1，提取温度100℃，加热并静态提取5min，对提取池体积30％的提取溶剂进行氮气吹扫60s后得到提取液。将提取液转移至50mL圆底烧瓶中，在35℃水浴中，通过旋转蒸发仪浓缩至小于3mL，转移剩余液体至10mL刻度离心管中，补加体积比为1:1的环己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待净化液，备用。凝胶渗透色谱(GPC)条件如下：净化柱：500mm×10mm，填装10gBioBeads-X3填料，柱床高32cm；流动相：体积比为1:1的环己烷和乙酸乙酯，流速为1.0mL/min；样品定量环为1mL；预淋洗体积为17mL；洗脱体积为15mL；清洗体积为5mL。称取3.0g制备好的样品并转移至陶瓷研钵中，加入60μL、浓度为1.0μg/mL的克霉唑-d₅标准溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，转移研磨好的样品于10mL的提取池中，进行加速溶剂(ASE)提取，提取条件为：提取溶剂为环己烷和乙酸乙酯，体积比为1:1，提取温度100℃，加热并静态提取5min，对提取池体积30％的提取溶剂进行氮气吹扫60s后得到提取液。将提取液转移至50mL圆底烧瓶中，在35℃水浴中，通过旋转蒸发仪浓缩至小于3mL，转移剩余液体至10mL刻度离心管中，补加体积比为1:1的环己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待净化液，备用。制备的待净化液1mL通过凝胶渗透仪按上述条件净化，收集洗脱液于刻度离心管中。将收集到的洗脱液于45℃的水浴中氮气吹至近干，取0.5mL乙腈饱和的正己烷涡旋振荡溶解残余物，再加入0.5mL正己烷饱和的乙腈，涡旋振荡并静置分层，吸出乙腈层于2mL进样小瓶中，向刻度离心管中重复加入0.5mL正己烷饱和的乙腈重复操作一次，合并乙腈层，过0.22μm滤膜于GC-MS/MS的进样小瓶中，制得待测样品溶液，供GC-MS/MS测定。制备不含待测组分的空白基质溶液五份各1mL，氮气吹干，再各取克霉唑标准品10mg，用乙腈溶解并转移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉唑标准储备液；取克霉哗-d5标准品1mg，用乙腈溶解并转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉哗-d₅标准储备液。用乙腈稀释配制浓度分别为1、2、5、20、50、100μg/L的系列标准工作溶液，其巾克霉哗-d₅同位素内标溶液浓度均为20μg/L。配制好的1、2、5、20、50、100μg/L的系列标准工作溶液1mL复溶，配得1、2、5、20、50、100μg/L的系列基质匹配标准工作溶液，其中克霉唑-d₅同位素内标的浓度均为20μg/L。

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