食源性致病菌的污染和增殖是严重威胁食品安全和公共健康的因素之一，成为人们关注的热点问题。根据世界卫生组织最新的统计数据，世界上每年有近十分之一的人因食品污染而患病，近42万人死于食源性疾病。食品添加剂作为延长食品货架期的一种手段，可以抑制食源性致病菌的生长，然而食品添加剂潜在危害及添加剂量成为消费者担忧的问题。同时，抗生素作为主要抑制食源性疾病的源头药物，其长期滥用导致食源性致病菌的耐药性问题愈发严重。鉴于此，研究人员不断寻找天然的防腐剂以及不易产生耐药性的天然抗菌物质作为食品添加剂及抗生素的替代品。

细菌素是细菌核糖体内合成的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白类物质，主要对亲缘关系较近的微生物有一定的抑制作用。细菌素具有高效、无毒、稳定性强、无残留以及不易产生抗药性等优点，被普遍认为是抗生素及化学添加剂的替代物之一。目前真正用于商业化的乳酸菌细菌素仅有乳酸链球菌素（nisin）和片球菌素（pediocinPA1）。造成这种现象的原因主要是乳酸菌细菌素的性质（如有些乳酸菌细菌素抑菌谱窄、pH敏感性及热稳定性差）和分离纯化方法等诸多因素限制了乳酸菌细菌素的获取及其工业化生产。筛选具有广谱抑菌作用，pH耐受范围广，热稳定性好的新型细菌素对食品安全具有重要意义。

芽孢杆菌（Bacillussp.）作为动植物和微生态的优势菌，不仅种类繁多、稳定性强，而且广泛存在于自然界中。由芽孢杆菌中地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、凝结芽孢杆菌（B.coagulans）等产生的细菌素也逐步被关注和发现。本研究从福建霞浦海域的牡蛎中分离出不同的细菌，并以常见的食源性致病菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、蜡样芽孢杆菌（B.cereus）、副溶血性弧菌（Vibrioparahemolyticus）等为指示菌，系统筛选具有广谱抑菌作用的产细菌素的细菌。其中分离出具有广谱抑菌活性的14株细菌经16srDNA基因鉴定为芽孢杆菌。这些芽孢杆菌所产的细菌素主要是由核糖体合成，并具有热稳定性和酶敏感性等特点。结合Ｔricine-SDS-PAGE电泳试验结果及LC-MS/MS鉴定，潜在细菌素的分子质量范围及对应的氨基酸序列均显示上述广谱细菌素可能未被发现。本研究发现的新型广谱细菌素期望为细菌素的开发利用及其在食品安全领域的应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品

牡蛎产自福建霞浦海域，样品放置于-18℃运至实验室备用。

1.2.1 试验设备

低温恒温培养箱（MIR-153），日本三洋（SANYO）电机公司；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50SII），上海博迅实业有限公司医疗设备厂；水平电泳槽及成像系统，美国Bio-rad公司；超净工作台（SEX-ＴＪ），上海整新电子设备；天平YP200N，上海菁海仪器有限公司；PCR仪（2720ＴhermalCycler），美国Ｔhermo公司；样品处理仪（MPFastprep-24），美国MP公司。

1.2.2 主要试剂

琼脂粉，上海蓝季生物科技有限公司；甘油、琼脂糖，均购于国药；基因组DNA提取试剂盒、DNAMaker、4sGreen无毒核酸染料、PCR引物，上海生工生物技术有限公司；Ｔaq酶、ddH2O，上海拜力生物科技有限公司；脑心浸出液（BrainHeartInfusion，BHI）培养基、乳酸菌培养基（MRS），英国OXIOD公司。

1.2.3 指示菌株

本次试验的指示菌株均由中国水产科学研究院东海水产研究所保存，所需的指示菌及培养条件等见表1。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

无菌条件下，称取10g牡蛎肉剪碎研磨，添加到装有90mL生理盐水的样品处理袋中，将样品在处理器中均质混匀2min，用生理盐水梯度稀释至10^-4备用。

1.3.2 菌株分离与培养

采用稀释涂布平板法对细菌进行单菌落分离。分别从10^-3、10^-4两个稀释度的稀释液中吸取100μL样品液于BHI培养基上，均匀涂布后置于30℃条件下过夜培养。长出菌落后，无菌条件下挑选单菌落，接种于5mLBHI液体培养基中，置于30℃条件下过夜培养。

1.3.3 产细菌素菌株的筛选

1.3.3.1 初筛

采用琼脂点种法进行细菌素初筛试验。将100μL过夜培养的指示菌添加到5mLBHI培养基（含0.8%的琼脂粉）中，倒入BHI培养基（含2.5%的琼脂粉）上，均匀平铺。待其冷却凝固并且干燥后，吸取2μL指标菌进行点样，置于30℃条件下过夜培养。培养结束后，在培养基上出现明亮抑菌圈的则认为有抑菌活性，能抑制相应的指示菌。对有抑菌活性的菌株在体积分数13%的甘油中保存，置于-20℃保存备用。

1.3.3.2 细菌素对热和酶的稳定性测试

1）细菌素的热稳定性试验：将过夜培养的指标菌液在10000r/min条件下离心5min。将上清液在沸水中放置15min，然后冰上冷却5min。吸取3μL加热后的上清液，进行琼脂点种法进行抑菌，未经热处理的上清液作为对照。

2）细菌素对酶的稳定性测试：将指标菌过夜培养，吸取2μL菌液，采用琼脂点种法进行抑菌试验；在点过指标菌位置的边缘，点上1μL质量浓度为20μg/mL的蛋白酶K，30℃条件下过夜培养。未经蛋白酶K处理的菌液作为对照。

1.3.4 产细菌素菌株的分类鉴定

1.3.4.1 形态特征

参照文献进行菌株形态特征鉴定。将菌株接种于BHI平板，37℃过夜培养，观察各个平板菌落形态，采用革兰氏染色法观察细菌形态。

1.3.4.2 菌株基因组DNA提取，PCR扩增和菌株鉴定

对具有抑菌效果的指标菌，按生工Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工）提供的使用方法提取其DNA。以指示菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用通用引物15F和12R（表2）进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）：ＴaqPCRMasterMix（2x，bluedye）（上海生工）25μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，基因组DNA模板2μL，双蒸水19μL。扩增反应条件为：94℃预变性4min；进入PCR循环阶段后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后在UＶ灯下观察到扩增条带后将未纯化的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行菌种鉴定。测序结果所得的基因序列通过在NCBI的Blast检索系统数据库中进行BLASＴ序列比对。

声明：本文所用图片、文字来源《中国食品学报》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：蜡样芽孢杆菌，乳酸菌，琼脂糖，琼脂粉