枯草芽孢杆菌中胞壁肽的分离纯化及其对芽孢的影响（一）

芽孢是细菌在环境胁迫（如低温、干旱和营养缺乏等）下形成的休眠体。因其独特的结构特性而对高温、高压、干燥、辐射、低温、腐蚀性物质等具有极强的抗性。如何将芽孢杀灭一直是食品杀菌领域亟待突破的关键问题。现阶段杀灭芽孢主要是靠传统的高温、高压的方法，然而高温、高压在杀灭芽孢的同时，也会引起食品营养流失，口感、风味等品质的严重下降。如何在常温下杀灭芽孢一直是食品领域研究人员的一大挑战。研究发现，当芽孢萌发后，其抗性消失，这也为杀灭芽孢提供了一个有效策略。如今，先萌发后杀灭是杀灭芽孢的一个最有效途径。

肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，由N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNac）通过β-1，4糖苷键连接聚合而成。与MurNac相连的依次是L-Ala，γ-Glu，m-Dpm和D-Ala。革兰氏阴性菌和阳性菌的主要区别在第3个氨基酸，大多数阳性菌的第3个氨基酸是L-Lys。胞壁肽是肽聚糖酶解后产物。研究表明，含有Dpm的胞壁肽是一种有效的萌发剂，能促进芽孢萌发。最小的有效结构单元的胞壁肽为二糖三肽，其二聚体或三聚体依然能诱导芽孢萌发。现如今，国内还没有关于胞壁肽分离纯化的报道，也没有关于胞壁肽对芽孢萌发的影响研究。本文通过酶解等方法成功分离纯化了胞壁肽，研究胞壁肽对于芽孢萌发的影响，为后续研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

枯草芽孢杆菌（Bacillus.subtilis168），购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。

1.2试验试剂

LB液体培养基，北京索莱宝科技有限公司；BacterialAgar（BD）；α-淀粉酶、胰蛋白酶、变溶菌素，购买自美国Sigma公司；其它试剂均为分析纯。

1.3仪器及设备

倒置荧光显微镜，德国蔡司公司；高效液相色谱，日本岛津公司；超高效液相-质谱联用仪，美国沃特世公司；电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；傅里叶变换红外光谱扫描仪，美国铂金埃尔默公司；500兆核磁共振谱仪，瑞士布鲁克公司；压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；多功能酶标仪，瑞士帝肯公司；均质破碎仪，美国Fastprep24；冷冻离心机，日本日立公司。

1.4试验方法

1.4.1枯草芽孢杆菌芽孢的制备

菌种先用LB琼脂培养基活化3代以上，接入2×SG培养基中涂板培养。在37℃培养2d后，用相差显微镜镜检芽孢，当视野中大部分芽孢从母细胞中脱落后，用冷的无菌去离子水将培养基上的芽孢清洗收集到离心管中，离心条件为8000g、4℃、10min，离心数次。离心过程中保证全程在低温条件中进行。离心后除去上清液，获得的芽孢沉淀重悬于ACES缓冲液（0.05mol/L，pH7.0）中，最后用相差显微镜镜检，视野中≥95%的芽孢呈现明亮状方可使用。芽孢浓度约为1.0×10⁸CFU/mL，存放于4℃冰箱，1个月内使用。

1.4.2芽孢平板计数

将芽孢悬浮液进行梯度稀释，枯草芽孢杆菌芽孢采用营养琼脂培养基进行倾注平板计数，每个平板中加入1mL稀释菌液。枯草芽孢杆菌芽孢在37℃条件下进行培养，培养24h。杀菌效果用芽孢减少的对数表示：lg（Nt/N0），其中，Nt为处理后存活的菌落数，N0为处理前菌落总数。

1.4.3芽孢萌发试验

吸取适量芽孢液于离心管中，加入适量萌发剂。放置在摇床中培养1h（37℃，200r/min）。之后将芽孢液放入80℃水浴中加热20min。平板计数计算芽孢萌发率。

1.4.4肽聚糖的提取

采用枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis168）的细胞壁提取肽聚糖。购买的菌种在液体培养基中活化3代后使用。将枯草芽孢杆菌接种到LB琼脂培养基上，于37℃培养24h。取新鲜单菌落接种到适量的LB液体培养基中培养至OD600约1.0，离心收集菌体（8000×g、4℃、10min），用冷的无菌去离子水清洗2次。将沉淀重新悬浮于8%SDS溶液中，煮沸30min，离心（13000×g，15min，25℃）收集沉淀，清洗数次直至除去残留的SDS。SDS处理除去了菌体的其它蛋白质，非共价结合的脂蛋白和脂多糖。将沉淀溶于无菌去离子水中均质破碎仪破碎细菌，不溶性细胞壁组分再通过离心收集（40000×g，30min，25℃）。收集的不溶性细胞壁进一步用α-淀粉酶、胰蛋白酶进行酶解，以除去细胞壁上的糖原、共价结合的蛋白质。以上两步酶解均在缓冲液中进行（10mmol/LＴris-HCl，pH8.0），在胰蛋白酶中需要加入10mmol/LCaCl2。将酶解液加入SDS（终质量分数1%）煮沸钝化胰蛋白酶，并清洗除去SDS。将细胞壁重新悬浮于氢氟酸（5mg细胞壁悬浮于2mL48%HF）中，4℃处理48h。HF可以除去肽聚糖上磷酸二酯键共价连接的次生细胞壁多糖，包括磷壁酸、poly-（β，1-6GlcNAc）等。细胞壁组分再分别采用8mol/LLiCl和0.1mol/LEDＴA清洗，无菌水清洗2次，最后采用丙酮除去脂磷壁酸和脂多糖。将样品冻干，得到肽聚糖。

1.4.5胞壁肽分离纯化

将提取的肽聚糖悬浮于12.5mmol/L磷酸盐缓冲液（1mmol/LMgCl2，pH6.0，0.02%叠氮化钠）中，加入5μg/mL变溶菌素，于37℃酶解24h。酶解的胞壁肽需要采用硼氢化钠还原，防止Cl的异构化。将胞壁肽悬浮于100mL0.5mol/L的硼酸盐缓冲液（pH9.0）中。胞壁肽还原采用新鲜配制的25mL，25mg/mLNaBH4，在加入过程中使pH保持在9.0。还原反应在室温中保持15min并不停地振荡，加入H3PO4使反应终止，将pH调至4。所得样品保存在-20℃。还原的胞壁肽采用HPLC（Shimadzu）分离，ODS色谱柱（Hypersiloctadecylsilanecolumn，250mm×4.6mm，颗粒：5μm，30105-254630，ＴhermoFisherScientific）。洗脱液分别是：A，40mmol/L磷酸钠（pH4.5）；B，40mmol/L磷酸钠（pH4.0）并加入20%（体积分数）甲醇。A、B流动相中加入0.00025%的叠氮化钠。色谱柱平衡柱子采用流动相A，柱温52℃，流速0.5mL/min，平衡1h。可溶性胞壁肽进样100μL，进样5min后，洗脱程序为B流动相以线性梯度从0到100%，时间为5min到270min，流动相流速保持在0.5mL/min。胞壁肽组分检测采用紫外检测器，波长为206nm

1.4.6胞壁肽组分脱盐

胞壁肽组分冻干后重新悬浮于无菌超纯水中，采用HPLC法进行脱盐，色谱柱为前述分离柱。柱子采用0.007%（体积分数）三氟乙酸平衡，柱温35℃，流速1mL/min，胞壁肽采用50%甲醇（0.0025%三氟乙酸）线性梯度（0～100%）洗脱，洗脱时间在30～50min之间，胞壁肽组分检测采用紫外检测器，波长为206nm。

1.4.7三重四级杆串联质谱鉴定

脱盐的胞壁肽组分采用三重四级杆串联质谱仪（QuattroMicro，Micromass）进行鉴定。全扫描模式（MSScan）质谱条件：正离子（ESI⁺）数据采集模式产生准分子离子峰[M+H]⁺；m/z扫描范围100～2000u；毛细管电压3.5kＶ；锥孔电压40Ｖ；萃取电压5.0Ｖ；离子源温度110℃；脱溶剂温度450℃；脱溶剂气650L/h；锥孔反吹气50L/h；RF透镜电压0.5Ｖ。

1.4.8红外扫描光谱

采用压片法将1.5mg冻干的GM-ＴriDAP与200mg干燥的KBr在玛瑙研钵中混合研磨均匀，置于磨具中，用压片机进行压片（压力为20～30MPa）1min，取下后得到透明的样品薄片，用傅里叶变换红外谱仪进行红外光谱的扫描，扫描范围4000～500cm^-1。

1.4.91HNMR

将2mg冻干的GM-ＴriDAP样品溶于1mLD2O中，冷冻干燥并重复3次将糖肽中的活泼H置换，溶于0.5mLD2O中后置于核磁管中，核磁共振分析采用500兆核磁共振谱仪，室温20℃，500MHz作氢谱。

1.5数据统计与分析

所有试验均重复3次。绘图使用Origin8.5软件。

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