农药残留的酶活性抑制与免疫分析技术的免疫分析法（九）

1、利用农药分子的原有基因合成：利用--农药分子中原有的活性基团，或经适当化学反应在农药分子上形成-C1、-COCl、-OH、-NH₂、-CHO等活性基团，然后再与适当试剂缩合，如氨基酸与酰卤或醛基、酸酐与羟基反应等，从而合成含适当长度“连接臂”的农药半抗原。比如可在碱性条件下将噻菌灵分子中的氨基与溴代丙酸缩合，合成噻菌灵半抗原。

2、利用合成农药的中间体或农药的降解产物(或结构类似物)合成：如克百威半抗原的合成，先用呋喃酚和光气反应生成2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋哺基氯甲酸酯，然后再和4-氨基丁酸或6氨基己酸反应得到保持克百威结构特征、具有羧基末端、含4个碳原子或6个碳原子“连接臂”的克百威半抗原。

3、从头合成：如三唑磷半抗原的合成，以三氯硫磷为起始原料，先与乙醇反应生成二氯硫代磷酸乙酯，再先后与苯唑醇、氨基己酸(或氨基丁酸)反应得到三唑磷半抗原N-[(O-乙基-O-苯基-1，2，4-三唑)硫代磷酰基]-6-氨基己酸(或丁酸)。

(二)农药人工抗原(免疫原和包被原)的制备

农药人工抗原的制备是指将农药半抗原与载体蛋白共价耦联的过程。制备人工抗原时应充分将农药的特征结构突出于载体蛋白表面。根据农药半抗原中活性基团的不同，可采用不同的方法与载体蛋白共价耦联。对于含活性羧基的农药半抗原，通常采用活性酯法、碳二亚胺法或混合酸酐法与载体蛋白的游离氨基形成酰胺键而共价耦联。对于含脂肪族伯氨的农药，通常通过戊二醛、二异氰酸酯、亚胺酸酯等连接剂与载体蛋白质共价耦联。对于含芳香族伯胺(芳香族硝基可先还原为氨基)的农药，可先反应生成重氮盐，再与载体蛋白分子中酪氨酸残基上酚羟基的邻位形成偶氮键而共价耦联。对于含羟基、氨基的农药，可先与琥珀酸酐、氯乙酸钠反应引入游离羧基，再与载体蛋白质耦联，对于含糖基的物质，分子中的邻二醇可被过碘酸盐氧化为醛基，再与载体蛋白质的游离氨基形成酰胺键而共价耦联。在制备人工抗原时，用于制备免疫原的载体蛋白和用于制备包被原的载体蛋白通常来自不同种属，这样可以在农药免疫分析中减少抗体与蛋白质的非特异性反应。

(三)抗体的制备与纯化

1、多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备用人工合成的免疫原免疫兔、羊等健康动物。

由于细菌、病毒等颗粒性抗原的免疫原性比人工抗原的免疫原性强，所以在用人工抗原免疫被细菌、病毒等病原物或寄生虫感染的动物时，难以获得对目标分析农药具特异性亲和力的抗体。

动物免疫方案：首次免疫以弗氏完全佐剂乳化免疫原使成油包水乳剂，用于皮内多点注射；加强免疫以弗氏不完全佐剂乳化免疫原使成油包水乳剂，用于皮内或皮下多点注射。免疫部位包括背部皮内和皮下、颈部皮下、腹腔、脚掌、腹股沟淋巴结等。未经佐剂乳化的水溶性免疫原，可进行肌肉注射或静脉注射。按免疫剂量，动物免疫分微量法、常量法和大量法。微量法的免疫原剂量在微克(μg)级，常量法多为1～2mg/kg(体重)，大量法的免疫剂量为50～100mg/kg每只动物；首次免疫的间隔时间一般3周左右，以后每隔7～10d加强免疫1次。4免后1周开始耳缘静脉采血，室温自然凝固后4℃放置过夜，分离血清。将抗血清按1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64……稀释，琼脂双向免疫扩散法测定抗血清效价达1∶64时，颈动脉采全血，室温自然凝固后4℃放置过夜。次日分离血清，加0.02％叠氮化钠于一20℃分管冻存，可保存3～5年。也可采用硫酸铵三步盐析法分离抗血清中的免疫球蛋白，必要时用免疫蛋白A或免疫蛋白G微球、离子交换柱色谱以及二乙胺乙基(DEAE)纤维素吸附法进一步纯化，冻干。抗体冻干粉于-20℃可保存5～10年。

2、单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备采用杂交瘤技术，具体步骤如下。

(1)动物免疫：用纯化抗原对8～12周龄的BALB/c健康小鼠进行腹腔注射免疫(水溶性抗原需先用弗氏完全佐剂充分乳化)。通常共免疫5～8次，免疫问隔时问为2～3周。检查抗血清的效价，末次免疫后3～4d，分离脾细胞。

(2)骨髓瘤细胞的培养：取Sp2/0骨髓瘤细胞株，先用含8-氮鸟嘌呤的培养基做适应培养，细胞倍增时间一般为10～15h，最高生长密度为9.0×10⁵个/mL。在细胞融合前1d，用新鲜培养基调节细胞浓度为2.0×10⁵个/mL，次日一般为对数生长期细胞。

(3)细胞融合：取具有高活性的骨髓瘤细胞和睥细胞按适当比例(一般1∶4)混合，加入聚乙二醇(PEG)使细胞彼此融合，然后用培养液稀释以消除聚乙二醇的作用。将融合后的细胞适当稀释后置培养板中培养。

(4)筛选：细胞培养至覆盖l0％～20％培养板的孔底时，吸取上清液用间接酶联免疫吸附测定法检测抗体含量，筛选出抗体含量高的分泌孔。将孔中细胞再克隆化，而后用酶联免疫吸附测定法进行抗原特异性测定，选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，液氮罐中冻存。

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