金属抗菌肽SIF4对大肠杆菌呼吸代谢的抑制

肉制品和乳制品等食品因富含蛋白质、多糖和脂质等营养物质而易受到食源性致病菌与腐败菌的生物污染，特别是大肠杆菌。本课题组前期研究发现，金属抗菌肽SIF4为金属阳离子抗菌肽，具有较好的胃肠耐受性和热稳定性，对大肠杆菌具有较好抑菌活性，对大肠杆菌最小抑菌浓度（MIC）为0.4 mg/L，对EMP和TCA关键酶有不同程度的抑制作用，可造成细胞质膜氧化损伤和诱导氧化应激产生过量活性氧自由基，破坏细胞质膜结构与功能，但SIF4对大肠杆菌菌体呼吸代谢及能量代谢抑制机理尚未可知。

鉴于EMP和TCA代谢的普遍性及其对大肠杆菌能量生成的重要性，湖南化工职业技术学院制药与生物工程学院着重从EMP和TCA视角分析金属抗菌肽SIF4对大肠杆菌呼吸代谢和能量代谢的影响，以期为SIF4在食源性大肠杆菌的生物防控提供理论支持。

1 对菌体新陈代谢活力的影响

取4 份菌悬液，分别加入SIF4使其终质量浓度为1/2 MIC、MIC和2 MIC（MIC为0.4 mg/L，通过前期研究确定），以不添加SIF4组为阴性对照。SIF4对大肠杆菌细胞代谢活力影响如图1所示。对照组（0 MIC组）菌体新陈代谢活力维持在正常水平，并未出现明显波动，表明菌体能量代谢生产与释放正常，细胞新陈代谢活力正常（＞97%）；经1/2 MIC、MIC和2 MIC的SIF4处理后，菌体新陈代谢活力显著下降（P＜0.05），具有新陈代谢活力细菌占比分别下降至（63.09±2.02）%、（47.45±2.11）%和（28.80±2.03）%，相比对照组，菌体新陈代谢活力分别下降了35.17%、51.23%和70.41%，表明SIF4对大肠杆菌菌体新陈代谢有一定抑制作用。前期研究表明，SIF4可能以“毯式”模型破坏大肠杆菌菌体细胞质膜结构，增强细胞质膜通透性，并引起细胞膜去极化，同时，SIF4还可导致细胞质膜氧化损伤并诱导氧化应激产生过量自由基，从而破坏细胞质膜结构与功能。大肠杆菌新陈代谢过程中，为其传递能量的电子传递链主要位于细胞质膜内表面，当菌体细胞质膜受到SIF4刺激与破坏之后，可能丧失为新陈代谢传递能量的功能，因此，菌体代谢活力显著降低。

2 对菌体呼吸代谢途径抑制的影响

EMP是大肠杆菌最重要的能量与物质代谢途径，HMP与EMP共同构成细胞糖分解代谢与有关合成代谢的调控网络。碘乙酸、丙二酸和磷酸钠分别是EMP、TCA和HMP途径的典型标准抑制剂，可抑制相应代谢途径从而降低呼吸代谢速率。

1/2 MIC、MIC和2 MIC组SIF4菌体呼吸抑制率分别为（6.692±0.451）%、（19.387±0.168）%和（25.222±0.326）%，呼吸抑制率与处理剂量呈正相关关系，且组间差异显著（P＜0.05）。碘乙酸、丙二酸和磷酸钠组菌体呼吸抑制率分别为（20.719±0.326）%、（24.047±0.165）%和（23.446±0.157）%，组间有显著性差异（P＜0.05）。如上文所述，当SIF4与典型呼吸抑制剂抑制的主要呼吸代谢途径相差越大时，由于增效作用，叠加率会越高，反之亦然，因此，若SIF4与典型抑制剂无协同增效作用，则叠加率较小，可由此判定SIF4的呼吸代谢抑制机理。

碘乙酸、丙二酸和磷酸钠与SIF4复配的呼吸叠加率分别为（1 9.982±0.133）%、（27.207±0.178）%和（33.304±0.566）%，碘乙酸和SIF4复配的呼吸叠加率最低，表明SIF4很可能通过抑制EMP影响菌体能量与物质代谢。前期研究发现，SIF4主要通过抑制大肠杆菌EMP的已糖激酶活性来表现高抗菌活性，本研究结果与前期研究所发现糖代谢抑制机理基本一致。

3 对菌体细胞质膜离子通道ATP酶的影响

Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶是极其重要的细胞质膜离子通道ATP酶，对维持细胞质膜通透性、结构完整性、低钠高钾胞内环境、静息电位以及信号传导有重要意义，Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶的活性受膜流动性影响并受ATP水平调控。

SIF4对细胞质膜离子通道Na＋K＋-ATP酶活性的影响，经SIF4处理后，菌体细胞质膜离子通道Na＋K＋-ATP酶活力与对照组相比均显著降低（P＜0.05），1/2 MIC组、MIC和2 MIC组处理8 h时Na＋K＋-ATP酶活力比处理4 h时均有所上升，分别从（30.47±0.92）、（23.69±0.86）、（21.67±0.95）U/mg上升至（31.80±0.91）、（26.03±0.72）、（23.99±0.44）U/mg，特别是MIC组和2 MIC组，组内差异均显著（P＜0.05）；8 h后Na＋K＋-ATP酶活力均显著下降，可能是由于SIF4处理前期菌体为应激适应阶段，通过增加细胞质膜离子通道ATP酶活力来增强菌体呼吸代谢和抵御外界不利环境；金属抗菌肽SIF4为金属阳离子抗菌肽，带正电荷，可与革兰氏阴性菌细胞膜上脂多糖（LPS）通过静电吸附作用结合于细胞膜脂质膜中，从而牵引整个抗菌肽分子进入质膜，扰乱质膜上蛋白质与脂质的有序排列，通过“位移”而聚合形成跨膜通道，从而破坏细胞膜结构完整性并导致胞内容物外溢，进而起到抑菌作用，推断细胞质膜是SIF4重要的抑菌效应靶点。TritonX-100组随处理时间延长，细胞质膜离子通道Na＋K＋-ATP酶活力显著下降，处理12 h时，Na＋K＋-ATP酶活力由初始的（39.03±1.00）U/mg显著降低至（2.41±0.67）U/mg（P＜0.05），降幅为93.83%，主要是由于TritonX-100为具有亲水和疏水基团的非离子型去垢剂，可将膜蛋白从细胞质膜解离，破坏细胞质膜结构并增强膜通透性。细胞质膜受损会影响能量代谢和膜内外质子浓度差，并影响Na＋K＋-ATP酶活性，使基于细胞膜的转运代谢无法完成并诱导细胞提前程序性凋亡。

SIF4对细胞质膜离子通道Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力影响，对照组Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力稳定，无明显波动（P＞0.05）。SIF4处理8 h后，与处理4 h相比，1/2 MIC和MIC组Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力略有上升，2 MIC组则呈下降趋势。SIF4处理12 h时，1/2 MIC、MIC和2 MIC组Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力由初始的（27.55±0.88）U/mg分别降至（20.27±0.58）、（14.30±0.74）U/mg和（7.65±0.53）U/mg（P＜0.05），降幅分别为26.42%、48.09%和72.23%，可能是由于SIF4破坏了细胞质膜结构，改变了细胞质膜通透性，使胞内Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋等离子泄露，破坏了膜内外离子电动势，从而使细胞质膜离子通道Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力显著下降；此外，1/2 MIC和MIC组出现短暂Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力升高现象，随后Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力显著降低，可能与菌体应激适应有关。有研究表明，胞内Ca2＋过量可损害能量系统结构和功能，诱导产生过量自由基并导致组织与细胞损伤，因此，Ca2＋Mg2＋-ATP酶活性与细胞质膜结构完整及细胞质膜氧化损伤有一定关系。本研究还发现，TritonX-100组Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力组内差异显著（P＜0.05），这与其具有很强的细胞质膜结构破坏作用和影响细胞质膜通透性能力有关。

4 对菌体胞内ATP生物合成的影响

当细胞质膜受损或细胞凋亡时，胞内ATP含量迅速下降，ATP含量变化能直接反映菌体存活状态。初始阶段组间胞内ATP含量无显著差异（P＞0.05）。处理4 h时，实验组与对照组均存在显著差异（P＜0.05），但1/2 MIC与MIC组、MIC与2 MIC组组间无显著性差异（P＞0.05），而1/2 MIC与2 MIC组存在显著性差异（P＜0.05），可能与1/2 MIC组处理剂量较低和处理时间过短有关；处理8 h和12 h时，组间均存在显著差异（P＜0.05）。本研究还发现，对照组培养0～12 h时，胞内ATP酶含量由初始（46.13±0.70）×10-6 μmol/g上升至（67.82±0.70）×10-6 μmol/g，增幅为47.02%，可能与菌体代谢旺盛，需要大量ATP为菌体物质代谢提供能量来源和碳骨架等中间体，以及菌体处于对数生长期等因素有关。TritonX-100组胞内ATP酶含量呈明显降低的趋势，从初始的（46.13±0.70）×10-6 μmol/g下降至处理12 h时的（6.09±0.72）×10-6 μmol/g，降幅达到86.80%，这与TritonX-100有较强的细胞质膜裂解能力有关；SIF4处理后，除呼吸代谢受到抑制外，胞内ATP含量也呈下降趋势，特别是2 MIC组对胞内ATP合成抑制最为明显，胞内ATP含量减少可能与ATP合成速率降低或胞内ATP水解加速有关，或与细胞质膜高度受损导致细胞质膜锚定的能量代谢酶功能受损、细胞质膜渗透性增加以及生物氧化与电子传递链不可逆受损等有关，本研究结果与Santos和Chingaté等报道结果相似。

5 结论

本实验研究了SIF4对菌体新陈代谢活力、呼吸代谢途径、细胞质膜离子通道ATP酶及胞内ATP生物合成的影响。结果表明，金属抗菌肽SIF4处理可显著降低菌体新陈代谢活力（P＜0.05），经2 MIC SIF4处理后，新陈代谢活力降低了70.41%；SIF4对菌体有较好的呼吸抑制作用，MIC和2 MIC组呼吸抑制率分别高达（19.39±0.17）%和（25.22±0.32）%；呼吸叠加率分析结果表明，SIF4可能通过抑制EMP影响菌体呼吸代谢；此外，SIF4处理后，大肠杆菌细胞质膜离子通道Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力显著降低（P＜0.05），推断细胞质膜是SIF4重要的抑菌效应靶点；处理8 h和12 h时，实验组组间胞内ATP含量均存在显著差异（P＜0.05），胞内ATP含量降幅最明显，特别是2 MIC组，可能与细胞质膜受损、ATP合成减少或消耗增加、细胞质膜通透性增加等因素有关。

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