分析玉米蛋白粉酶法修饰产物抗氧化及质量特性（一）

玉米蛋白粉是玉米淀粉或糖浆加工的主要副产物，据估计，每加工1吨的淀粉糖浆，可产生150～200kg的玉米蛋白粉。我国每年玉米淀粉糖浆产量约为800万吨，由此估算，玉米蛋白粉年产量约为120～160万吨。玉米蛋白粉中蛋白质含量高达60%左右，多为不溶于水的醇溶蛋白和谷蛋白，有特殊气味和颜色，溶解性差，口感粗糙，难以直接用于食品加工，多用于饲料。因此，对于玉米蛋白粉中的蛋白质进行有效提取和利用，是提高玉米资源综合利用率的重点。研究表明，酶法改性可有效提高蛋白质的溶解性，改善其加工性能。刘冬等人研究发现采用蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白时，复合酶解时水解度显著比单酶水解高，水解度最高可达29.95%。金英姿等人采用木瓜蛋白酶酶解玉米蛋白制备出高F值寡肽，F值大于20。玉米蛋白中含有较多的疏水性氨基酸、中性氨基酸和支链氨基酸等，缺乏赖氨酸和色氨酸，这种特殊的氨基酸组成使其成为很好的开发活性肽的来源。

刘祥等人采用复合蛋白酶及碱性蛋白酶对玉米蛋白酶进行酶解，发现其酶解产物抗氧化活性较强。HUANG等人研究表明玉米多肽产物对自发性高血压大鼠有明显的降血压作用。Ma等人用碱性蛋白酶制备的玉米肽，经过分离纯化后得到具有显著降低体内酒精含量的五肽。梁秋芳研究发现利用碱性蛋白酶制备出的玉米多肽对结肠炎有很好的抗炎活性。

目前，对玉米蛋白酶法改性产物抗氧化活性及质量特性系统研究较少，本文选择三种不同的蛋白酶对玉米蛋白粉进行酶法增溶改性，以氮溶指数为指标确定酶组合及条件，并研究酶法修饰产物抗氧化活性和质量特性，为开发玉米蛋白深加工制品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验原料

玉米蛋白粉：购自郑州坤利食品添加剂有限公司。粉碎、过60目筛网，经淀粉酶法去除部分残余淀粉后，干燥，装入塑料自封袋内备用。

1.2 仪器设备与试剂

1.2.1 仪器设备

HH-2型数显恒温水浴锅：金坛市荣华仪器制造有限公司；L550型台式低速离心机：湘仪实验室仪器开发有限公司；T6型可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；K1100全自动凯氏定氮仪：济南海能仪器股份有限公司；MKXM1-T型马弗炉：中国迈可威公司；L550型台式低速离心机：湘仪实验室仪器开发有限公司；DF-101Z型集热式恒温加热磁力搅拌机：河南省予华仪器有限公司；YRE-301型旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限公司；JL-1155型激光粒度仪：成都精新测试设备有限公司；S433D氨基酸自动分析仪：德国Sykam（赛卡姆）公司。

1.2.2 主要试剂

酶制剂：中性蛋白酶（10万U/g）、碱性蛋白酶（10万U/g）、风味蛋白酶（10万U/g），购自南宁庞博生物工程有限公司；大豆油：食品级，山东鲁花集团有限公司。邻二氮菲、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等常规化学试剂，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 营养组分测定

水分含量测定采用直接干燥法，参照GB5009.3-2016。蛋白质含量测定采用凯氏定氮法，参照GB5009.5-2016。淀粉含量测定采用酸水解法，参照GB5009.9-2016。灰分含量测定，参照GB5009.4-2016。氨基酸含量分析采用氨基酸自动分析仪法，参照GB5009.124-2016。

1.3.2 玉米蛋白酶解产物的制备

称取玉米蛋白粉各15g，加入100mL蒸馏水，搅拌均匀，调节温度为50℃，之后加入蛋白酶（添加量均为1.0%），在匀速搅拌条件下酶解4h。酶解结束后，灭酶（95℃，20min），离心（4000r/min，5min），取上清液。沉淀加20mL蒸馏水溶解，提取10min后离心，合并上清液，定容，为玉米蛋白酶解液。真空浓缩后冻干，可得玉米蛋白酶解产物。
1.3.3酶解条件的筛选

式中：m¹—样品酶解产物中蛋白质的含量，g；

m—酶解前样品中总蛋白质含量，g；

蛋白质含量测定均采用凯氏定氮法，参照GB5009.5-2016。

分别制备中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶单酶酶解以及复合酶解的酶解产物，以氮溶指数为筛选条件，确定较好的酶组合及条件，之后在该条件下制备酶解产物并对其抗氧化活性及质量特性进行分析。

1.3.4 抗氧化活性测定

1.3.4.1 还原能力的测定

还原能力的测定采用铁氰化钾法，参照秦娟娟等人的方法。分别配制2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL的玉米蛋白酶解产物及玉米蛋白样品溶液，测定各样品对Fe³⁺的还原能力。取各样品溶液1mL，加入0.2mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=6.6）和1%铁氰化钾溶液各1.0mL，之后混合均匀，50℃水浴保温20min，取出冷却到室温，加入10%的三氯乙酸溶液1.0mL，4000r/min条件下离心10min。取2.0mL上清液，加入蒸馏水2.0mL，再加入0.4mL0.1%的FeCL₃溶液，混合均匀，700nm处测定样品吸光度，样品的还原能力以该波长下的吸光度来表示。

1.3.4.2 羟基自由基清除率的测定

羟基自由基清除率的测定采用邻二氮菲法，参照张康华等人的方法。分别配制1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL的玉米蛋白酶解产物及玉米蛋白粉样品溶液，测定各样品羟基自由基清除率。取1mL3.75mmol/L的邻二氮菲溶液于试管内，加2mLpH为7.40的磷酸盐缓冲溶液，加入1mL样液，混匀后加入1mL3.75mmol/L的硫酸亚铁溶液，摇匀，再加入1mL0.05%的双氧水，37℃水浴中保温1h，之后在536nm处测定样品吸光度As用蒸馏水替代样品，同样操作测定吸光度A_p。用蒸馏水替代样品及双氧水，同样操作测定吸光度A_b。

1.3. 5酶解产物质量特性分析

1.3.5.1 酶解物溶解度测定

取50mLpH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0左右的溶液，各加入2g酶解产物，搅拌溶解2h后离心（4000r/min，5min），上清液用蒸馏水定容至100mL。取10mL水解液置于铝盒中于105℃烘箱内烘至恒重。同样条件下测定玉米蛋白粉的溶解度。

式中：m₂——样品和铝盒恒重后的总重，g；

m₀——空铝盒恒重后的质量，g；

m——样品的质量，g；

10——取样倍数。

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