云南松针精油的提取及抗氧化活性研究与应用（一）

云南松（Pinusyunnanensis）系松科（Pinaceae）松属（Pinus）植物，主要分布于我国四川、云南、广西等地区。作为松属植物重要的林产品之一，松针精油近年来受到广泛关注和研究。其挥发油中主要含有α-蒎烯、β-蒎烯等萜烯类成分，具有明显的镇咳和祛痰作用，并有抗真菌、细菌和抗肿瘤活性。国内种植的云南松、湿地松、油松、前红松、加勒比松、云南松、华北落叶松等松树种类的松针挥发油的成分研究已有报道，研究结果表明其组分及含量可因地域、树种、生长环境、采收季节和提取方法的不同而有一定差异。云南松科植物资源丰富，主要海拔多为600～2100m地区，本文开展云南松针精油提取和抗氧化活性研究，探索共水法提取松针精油的最佳工艺，对于云南松的综合利用具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：云南松新鲜针叶，采于云南省保山市隆阳区，经保山学院汪建云教授鉴定系云南松（Pinusyunnanensis）的针叶，清水洗净，晒干备用。

试剂：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美国Sigma公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）：合肥博美生物科技有限公司；过硫酸钾、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、硫酸亚铁、三氯化铁、水杨酸：天津市风船化学试剂科技有限公司；30％的H₂O₂、氯化亚铁：天津市巴斯夫化工有限公司；结晶紫、草酸铵、抗坏血酸、氢氧化钠：西陇科学股份有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计（UV2600）：日本岛津；气相色谱-四极杆质谱联用仪（TRACEDSQ）：赛默飞世尔科技有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；N-1001旋转蒸发仪：东京理化；TDL-4低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；PE30酸度计：梅特勒-托利多。

1.3 方法

1.3.1 云南松针精油的提取方法

称取100g2～3mm小段的云南松针叶（鲜叶），置于1000mL圆底烧瓶中，按料液比加入含有NaCl的蒸馏水，浸泡3h，再共水蒸馏，收集玻璃分水器中的上层精油，并用无水NaSO₄干燥，过滤，得无色透亮云南松针精油，于4℃下保存，备用。出油率%=精油质量（g）/鲜云南松针质量（g）×100%。

1.3.2 单因素试验

以出油率为指标，分别考察NaCl用量、料液比、提取时间和浸泡时间4个因素对松针精油出油率的影响。设定NaCl用量为6%，料液比为1:6g/mL，提取时间为3h，浸泡时间为2h，固定其它条件，分别考察NaCl用量（0%、2%、4%、6%、8%、10%），料液比（1:3、1:4、1:5、1:6、1:7g/mL），提取时间（1、2、3、4、5h），浸泡时间（0、1、2、3、4h）对出油率的影响。

1.3.3 正交实验

依据单因素实验结果，选择NaCl用量（A）、料液比（B）、提取时间（C）和浸泡时间（D）四个因素进行L₉（3⁴）正交实验，优化松针精油的提取工艺（见表1）。

1.3.4 云南松针精油GC-MS测定

采用GC-MS对云南松针精油进行成分分析。气相色谱条件为：色谱柱：型号DB-17，规格30m×0.25mm×0.25μm；载气为He，进样口温度：230℃；流量：1.0mL/min。升温程序：起始50℃，保持4min；5℃/min升温到70℃；20℃/min升温到120℃；10℃/min升温到170℃；5℃/min升温到200℃；40℃/min升温到280℃。质谱条件为离子源：EI，电离能70eV，离子源温度：200℃。

1.3.5 云南松针精油的理化性质测定

松针精油折光指数的测定：GB/T14454.4-2008；旋光度的测定：GB/T14454.5-2008；相对密度的测定：GB/T14455.4-2008。

1.3.6 云南松针精油的抗氧化活性测定

1.3.6.1 松针精油的总抗氧化活性（ABTS法）

准确配制7.40mmol/L的ABTS和2.60mmol/L的过硫酸钾试剂，按1:1体积比混合均匀，室温下避光放置12～16h，得ABTS⁺自由基储备液。在734nm处，用无水乙醇将ABTS⁺自由基储备液稀释至吸光度0.7±0.02，于4℃冰箱储存备用。准确移取3.9mLABTS⁺自由基溶液，加入不同质量浓度（20.40、10.20、5.10、2.55、1.28、0.64mg/mL）的松针精油（无水乙醇作溶剂），混合均匀后在室温下避光静置3.5h，于734nm处测定吸光度AE，以维生素C为对参照。以相同体积的无水乙醇作对照，测定吸光度AB。ABTS⁺自由基的清除率为：ABTS⁺·清除率%=（A_B-AE）×100%/A_E。

1.3.6.2 松针精油对DPPH·的清除能力

准确配制25.60mg/L的DPPH溶液（无水乙醇作溶剂），准确移取3.90mL，加入0.1mL不同浓度（102.20、51.10、25.50、12.75、6.38、3.19mg/mL）的松针精油，混合均匀，室温避光反应30min后，于波长517nm处测定吸光度A_i，无水乙醇作对照，测得吸光度Ac，同时测定3.90mL的无水乙醇中加入0.1mL不同浓度的松针精油混合液的吸光度A_j，并以维生素C为对照。

DPPH自由基的清除率为：DPPH·清除率%=

1.3.6.3 松针精油对OH·的清除能力（结晶紫法、水杨酸法）

结晶紫法：在7支20mL比色管中分别加入0.3mL结晶紫（0.4mmol/L），1.2mLFeSO₄溶液（1mmol/L）和0.6mLH₂O₂溶液（2.0mmol/L），混匀后用pH=4.0的缓冲溶液定容至10mL，摇匀，放置30min后，在580nm处测吸光度值Ab，同样的方法测定不加H₂O₂时580nm处的吸光度A₀。则羟自由基的产生量可以用ΔA=A₀-A_b来表示。表观抗羟自由基氧化率的测定方法：在加H₂O₂之前分别加入1mL不同浓度的松针精油（20.40、10.20、5.10、2.55、1.28、0.64mg/mL），测定其吸光度As，并以维生素C为对照，则表观抗羟自由基氧化率S可以按下式计算：S=（As-Ab）×100%/（A₀-A_b)。

水杨酸法：向比色管中加入2.0mL0.02mol/LFeSO₄溶液、2.0mL1.0mmol/LH₂O₂溶液，震荡均匀，于517nm处测得吸光度为A参比；再加入6.0mmol/L水杨酸3.0mL，摇匀后于37℃水浴15min，测定其吸光度为A_对照；在测得A参比后向比色管中加入不同浓度（20.40、10.20、5.10、2.55、1.28、0.64mg/mL）的松针精油2.0mL，摇匀后，室温避光放置30min，测其吸光度为A_样参；向比色管中加入2.0mL0.02mol/LFeSO₄溶液、2.0mLH₂O溶液，吸光度值为A_样品。清除率的计算公式为：

OH·清除率%=

1.3.6.4 松针精油对Fe3+的还原能力（普鲁士蓝法）

在2.5mLpH=6.6的磷酸盐缓冲液中依次加入不同质量浓度（20.40、10.20、5.10、2.55、1.28、0.64mg/mL）的松针精油2.5mL，质量分数为1％的铁氰化钾溶液2.5mL，混合均匀后在50℃恒温20min，冷却，再加入2.5mL质量分数为10％的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min离心分离10min，取上层清液5mL，加蒸馏水5mL和质量分数0.1％FeCl3溶液1.0mL，避光静置12小时后，在波长700nm处测定吸光度，并以维生素C为对照。

1.3.7 数据处理

试验重复3次，采用excel、origin9.5软件作图，SPSS22.0统计软件分析。

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