液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中氯霉素和氟苯尼考残留量的研究（一）

1 引言

氯霉素是第一个人工合成的广谱抗生素，因其效高价廉，在中国畜牧业中得到广泛应用，对畜禽疾病的控制和治疗起到了重要的作用。随着氯霉素的广泛应用及研究的深入，发现其有许多毒、副作用，因此，必须控制氯霉素在动物性食品中的残留，保障消费者健康与安全。试验结果表明，蛋鸡多剂量内服氯霉素后，氯霉素在鸡蛋中的药动学特征是：易于吸收，多分布于蛋黄；氯霉素在蛋黄中的残留水平高，且在蛋黄中的消除较蛋白缓慢。中华人民共和国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定氯霉素禁止用于所有食品动物。氟苯尼考是一种农业部批准使用的动物专用抗菌药，主要用于敏感细菌所致的猪、鸡、鱼的细菌性疾病，尤其对呼吸系统感染和肠道感染疗效明显，GB31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定家禽产蛋期禁止使用氟苯尼考。目前检测鸡蛋中氯霉素类药物残留量主要采用国家标准GB/T22338—2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》，在检测鸡蛋过程中发现一些可以优化和改进的步骤。本方法是采用液相色谱-串联质谱法对鸡蛋中的氯霉素和氟苯尼考残留量的检测方法的研究，鸡蛋中的氯霉素、氟苯尼考残留物通过制备、提取、净化、氮吹、复溶，过滤后进液相色谱-串联质谱仪进行分析测定。通过改进和优化，本方法更加简便、快捷、准确的测定鸡蛋中的氯霉素、氟苯尼考。

2 材料和方法

2.1 试剂与材料

ABSCIEXAPI4000+UPLC/MS/MS质谱联用仪（美国ABSciex公司，配有Turbo-V离子源、蠕动泵和Analyst1.5.2数据处理系统）；WatersAcquityUPLC超高效液相色谱仪；WatersACQUITYUPLC BEH1.7μmC18（2.1×100mm），KQ-250DV超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Millipore超纯水机（美国Milipore公司）；LC-Si硅胶小柱（3mL，200mg，美国WATERS公司）；0.22μm有机系针筒式微孔滤膜（上海安谱公司）；色谱纯乙腈（德国，默克公司）；色谱纯甲醇（德国，默克公司）；色谱纯正丙醇（德国，默克公司）；色谱纯丙酮（赛默飞世尔科技（中国））；色谱纯正己烷（罗恩试剂）；XS205DU电子天平（梅特勒）；氯霉素、氯霉素D5和氟苯尼考标准品均购于坛墨质检科技股份有限公司。

2.2 样品前处理

鸡蛋经搅拌混匀，取5g置于50mL离心管中，加入内标工作溶液100μL和30mL5%甲酸乙腈溶液，均浆，10000r/min离心5min，取上清液转入250mL分液漏斗中，加入15mL乙腈饱和的正己烷，振荡5min，静置分层，乙腈层转移至100mL棕色鸡心瓶中，残渣用30mL乙腈重复提取一次。混合乙腈层，向鸡心形瓶加入5mL正丙醇，40℃水浴中旋转浓缩至近干。残渣以5mL丙酮+正己烷（1+9）溶解。残渣溶解液全部过LC-Si硅胶小柱（预先以5mL丙酮+正己烷（1+9）活化），再用5mL丙酮+正己烷（6+4）洗脱，收集洗脱液于15mL离心管中，40℃水浴中氮气吹干，以1mL（v）5%甲酸乙腈复容，过0.22μm滤膜，待测。空白试验：除不称取样品，其余操作同上提取净化步骤。

2.3 仪器条件

液相分离条件：色谱柱：C18色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm）。流动相：A相水；B乙腈。流速：0.3mL/min；柱温：35℃，进样体积2μL。梯度洗脱程序见表1。

质谱检测条件：离子源：电喷雾电离源（ESI-）；检测方式：多选择反应监测（MRM）；喷撞气CAD：中速；气帘气CUR：35psi；喷雾气GS₁：50psi；辅助加热气GS₂：50psi；雾化电压：-4500V；离子传输温度：550℃。

2.4 标准溶液配制

分别取氯霉素、氟苯尼考标准溶液（1000μg/mL）0.1mL、氯霉素D5内标溶液（100μg/mL）0.1mL至100mL容量瓶，用乙腈定容，配制成1μg/mL的标准中间液和100ng/mL氯霉素D5内标工作溶液。取1mL标准中间液至10mL容量瓶中，以乙腈稀释并定容成浓度为100ng/mL的标准工作溶液，分别移取标准工作溶液0.05、0.1、0.5、2.0、5.0mL及氯霉素D5内标工作溶液1mL于10mL容量瓶中，用流动相稀释制成浓度为：0.5、1.0、5.0、20.0、50.0ng/mL的标准工作溶液，吸取0.25mL氯霉素、氟苯尼考标准溶液（1000μg/mL）定容到1mL，得250.0ng/mL标准溶液，氯霉素、氟苯尼考标准曲线范围0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0、250.0ng/mL。氯霉素内标浓度为10ng/mL。

3 结果与分析

3.1 质谱条件的确定

氟苯尼考含有酰胺基团，在负离子模式下易形成［M+H］⁺准分子离子，目前研究检测氟苯尼考（LC-MS/MS）方法均采用负离子模式，分别取100ng/mL氯霉素、氟苯尼考标准溶液、氯霉素D₅内标溶液进质谱，通过全扫描（SCAN）和选择离子监测（SIM）进行条件优化，氯霉素等药物信息及质谱参数优化条件见表2。

3.2 液相条件的确定

流动相水相比较了纯水、0.1%甲酸水溶液，5mmol乙酸铵溶液，有机相比较了甲醇和乙腈等组合时色谱峰的出峰情况。用纯水作为流动相，水相比较0.1%甲酸水溶液、5mmol乙酸铵溶液，基线噪音略大，水相为0.1%甲酸水溶液，氯霉素、氟苯尼考峰形较好，但是氟苯尼考的响应值较纯水作为流动相下降很多；用5mmol乙酸铵溶液作为水相，氟苯尼考的响应值较纯水作为流动相也下降近50%；有机相选用甲醇和乙腈时，使用乙腈时氟苯尼考的响应更好，而且最终样品以5%甲酸乙腈溶解，选择水和乙腈作为流动相。

3.3 前处理条件优化

本文比较了乙腈、1%甲酸乙腈，5%甲酸乙腈作为提取溶剂时加标回收率情况，使用5%甲酸乙腈作为提取溶剂，样品加标回收率更好，故样品前处理使用5%甲酸乙腈作为处理溶剂。40℃水浴中氮气吹干后，复溶试剂的选择，GB/T22338—2008标准中以1mL水作为溶剂溶解，通过实验比较表明：水作为复溶的溶剂做出的回收率较低，特别对于氟苯尼考使用的是外标法定量，即使氯霉素使用内标法测定结果也是偏低，用水复溶效果不理想，改用1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈复溶，氯霉素和氟苯尼考的响应值都得到改善，回收率也大大提高，5%甲酸乙腈溶解的标准品峰形更好，所以选择5%甲酸乙腈作为复溶的试剂。

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