高效液相色谱-蒸发光散射检测法检测三氯蔗糖及其相关物质的含量（一）

三氯蔗糖（Sucralose）是一种重要的食品添加剂，它可替代蔗糖有效改善食品的口味，适应了人们对食品色香味的需求，同时由于其安全性可有效地避免糖所带来的疾病可能性，是目前国际上技术含量最高的功能性甜味剂，是近年来全球食品添加剂市场增速最快的市场板块，它一定程度上代表了一个国家甜味剂生产领域的科技水平。三氯蔗糖生产过程中影响其口味的原因主要是其副反应产生的中间产物导致，此外三氯蔗糖的氯代基团的位置不同其甜度也会有很大影响。有研究表明，蔗糖C-4、C-1′、C-4′、C-6′上任何位置被卤素取代，所得蔗糖卤代衍生物甜度都比蔗糖强，而C-6上的取代则可能导致甜味降低甚至产生苦味。而4，1′，6′-三氯蔗糖在相关性产物中的甜度最高，而且最容易得到；其次，其他副产物的存在会影响整体产品的甜度。本文建立了一种有效分析三氯蔗糖及其相关产物含量的检测方法。

1 材料与设备

三氯蔗糖：纯度≥99.5%，山东三和维信生物科技有限公司；甲醇：高效液相色谱用，天津市大茂化学试剂厂；ProntoSILKromaPlusC18：150×4.6mm，德国BISCHOFF；自动进样器：SIL-16，岛津仪器（苏州）有限公司；高效液相色谱仪：EasySep-1020，上海通微分析技术有限公司；蒸发光散射检测仪：UM5800，无锡通微检测技术有限责任公司；空气泵：XWK-Ⅲ，天津市津分分析仪器制造有限公司；电子分析天平：FA1004B，上海佑科仪器仪表有限公司。

2 方法

2.1 标准曲线绘制

2.1.1 配置不同浓度的三氯蔗糖样品

称取0.05g（精确至0.0001g）三氯蔗糖标准样品，加入50%甲醇-水溶液稀释至20g（精确至0.0001g），分别称量5g、2g、1g、0.5g、0.4g、0.2g、0.1g、0.05g（精确至0.0001g）的稀释液并用甲醇-水溶液分别定容至10g、10g、10g、10g、20g、20g、20g、20g（精确至0.0001g），通过称量比例计算9个三氯蔗糖样品的准确浓度。

2.1.2 梯度洗脱比例设定

流动相使用甲醇（A）与水（B），根据甲醇与水对三氯蔗糖及其相关产物在流动相中与固定相相互作用的极性不同，分别配置20%、30%、40%、80%的甲醇-水流动相，利用三氯蔗糖生产过程中的成分混杂的结晶母液来观察物质分离情况制定适宜的梯度。

2.1.3 HPLC-ELSD检测

连接高效液相色谱仪、蒸发光散射检测仪、空气泵、自动进样器、C18色谱柱，设定柱温箱温度为35℃，雾化器温度75℃，空气流量2.5L/min，进样量20μL，流动相比例按照2.1.2梯度洗脱比例设定，流动相流量1mL/min。将2.1.1所配置的9个样品浓度从低到高依次放入自动进样器，进样时间设定35min，依次开始检测，得到相对应的6.5min左右得到的三氯蔗糖的峰面积。

2.1.4 标准曲线拟合

分别取不同三氯蔗糖样品浓度及峰面积的对数，通过数据拟合得到y=kx+b的两元一次方程，其中x为峰面积对数，y为浓度对数。

2.2 含量检测

2.2.1 样品配置

称量0.1g（精确至0.0001g）三氯蔗糖样品，记为m，用50%甲醇-水溶液定容至20g（精确至0.0001g），记为M，于自动进样器中按照2.1.3方法检测其相应峰面积，记为A，其余杂质也可按照此方法计算其含量。液体样品也可按照此方法进行检测。

2.2.2 含量计算

将以上峰面积代入公式（1）

式中：C—三氯蔗糖或其他相关物质含量；

A—样品峰面积；

m—称量固体质量；

M—定容样品质量。

2.3 物质定性

使用C18反向色谱柱对各种物质进行分离。根据色谱柱分离原理，各种杂质的出峰次序是根据物质的极性强度，从高到低依次出峰。这一点也通过使用HPLC-MS液质联用的质谱分析得到验证。一方面TOF-MS质谱分析中，分子离子峰明确，可以确定物质分子量；另一方面，通过氯元素同位素在自然界中的丰度，可以从质谱谱图中非常明确的确定物质分子中含氯原子的个数。综合这两点，和实际反应可能产生的各种衍生物，基本可以确定各个HPLC峰对应的物质的分子式。

3 结果

3.1 标准曲线绘制

3.1.1 甲醇-水比例下高低极性物质出峰情况

以图1为例，三氯蔗糖结晶母液在不同浓度的甲醇溶液中各组分极性表现不同，可通过此情况设定梯度分离比例，将各组分分离的更加精确。

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