新型壳聚糖-岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子研究（一）

口服药物给药方式简单，不损伤皮肤和黏膜，无交叉感染。是目前药物疗法最常用的给药途径。然而，药物在胃、肠道环境中的稳定性极大地限制了药物的利用率。许多药物仍需以注射的方式给药。如何提高药物的口服利用率，构建口服药物载体。仍是现阶段亟待解决的问题。近年来提出的纳米载药体系主要是利用具有一定特性的纳米载体，将药物包裹入内，提高其稳定性和利用率，现已成为国内外药剂学研究的热点圈。为了防止药物进入肠道之前在胃中分解,纳米口服药物载体的构建需要考虑胃、肠道pH值的变化，使用对pH值敏感的载体系统。壳聚糖一岩藻聚糖硫酸酯纳米载体系统是常用的活性物质运载体系。壳聚糖是一种天然阳离子多糖，具有良好的安全性、生物相容性、pH值敏感性，可以通过增强细胞旁路的药物转运，促进药物的吸收利用，这使其在口服药物领域具有一定优势。岩藻聚糖硫酸酯是褐藻和海洋无脊椎动物中常见的硫酸化多糖，含有大量的硫酸基团，可与带正电的壳聚糖通过聚电解质自组装的方式形成纳米粒子。岩藻聚糖硫酸酯自身具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种活性，进入体内后不仅很少引起副反应，而且还可以辅助所运载的活性物质发挥作用。是一种良好的载药纳米粒子构建材料。据报道。壳聚糖-岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子已作为多种生物活性物质的运载体，如生长因子、抗肿瘤药物等。Pinheiro等采用自组装法制备壳聚糖-岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子，用其运载生物活性物质；Huang等将封装有碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖-岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子应用于神经组织工程；Huang等将制备的壳聚糖-岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子用于抗肿瘤药物姜黄素的运载，增加了姜黄素的生物利用度。目前，纳米粒子的制备多采用商品化的海带、墨角藻等来源的岩藻聚糖硫酸酯，对于其它褐藻来源的岩藻聚糖硫酸酯的研究较少。本文从常见、易得的大型海藻羊栖菜中提取得到岩藻聚糖硫酸酯。制备新型壳聚糖-岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子，测定不同岩藻聚糖硫酸酯/壳聚糖比例的纳米粒子在人工胃、肠液中的稳定性，寻找适用于运载口服药物的新型壳聚糖-岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊栖菜购于浙江温州海虎海藻养殖有限公司。葡聚糖标准品(重均分子质量分别为21.1，47.1，107，200，344，708ku)，美国Flu-ka公司；10种单糖标准品(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮和标准牛血清白蛋白，美国Sigma公司；乙腈(色谱纯级)，美国Tedia公司；壳聚糖(脱乙酰度80％～95％)，国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均为国产分析纯级。
Agilent1260高效液相色谱仪、AglientElipseXDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，美国Agilent公司；ShodexohpakSB-804HQ高效凝胶渗透色谱柱，日本Shodex公司；InfiniteM200PR0酶标仪，瑞士Tecan公司；800Y高速多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；超声波破碎仪，德国Bandelin公司；Brookhaven粒度仪。美国布鲁克海文仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯的提取

羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯的提取参照Silchenko等和刘雪等的方法。将新鲜羊栖菜洗净，40℃干燥72h，粉碎。取适量藻体粉末。95％乙醇脱脂(料液比1:30)，室温搅拌24h。脱脂后进行提取，提取条件：2％CaCl₂溶液，料液比1:30，60℃提取3h。提取完毕后，冷却离心，收集上清液，超滤浓缩，截留分子质量100ku。液体浓缩至原体积的1/10，加入4倍体积95％乙醇，醇沉，沉淀经无水乙醇脱水、烘干后得到羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯，命名为SFP。

1.2.2 分子质量测定

多糖分子质量的测定采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC法)。色谱条件：ShodexohpakSB-804HQ分析柱(7.6mm×300mm)；流动相为0.1m01/LNa₂S0₄；流速0.5mUmin；柱温35℃；进样量20μL；检测器采用示差折光检测器。以标准品分子质量的对数为纵坐标，保留时问为横坐标，绘制标准曲线。计算样品的分子质量。

1.2.3 单糖组成分析

采用PMP柱前衍生高效液相色谱法测定SFP的单糖组成。多糖完全酸水解：准确称取2mg样品，加入1mL三氟乙酸(2mol/L)，110℃降解6h，去除多余三氟乙酸，得到完全酸水解的样品。多糖PMP衍生：多糖降解产物及单糖标准品溶于100μL蒸馏水中，随即加入100μLNaOH溶液(0.3mol/L)及120μLPMP甲醇溶液(0.5mol/L)，70℃水浴反应100min。反应结束后加入100μLHCl溶液(0.3mol/L)中和，二氯甲烷萃取3次，上层液体经0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。色谱条件：AgilentEclipseXDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为CH₃CN：PBS(磷酸盐缓冲液，pH6.7)=17:83(体积比)；进样量10μL；柱温35℃；紫外检测器检测波长254nm；流速1.0mL/min。

1.2.4 理化性质分析

SFP的总糖含量、蛋白质含量四、硫酸基含量、糖醛酸含量圈分别按照相应的文献进行测定。

1.2.5 壳聚糖-岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子(Cs-FucNPs)的制备

配制1mg/mL的壳聚糖(Cs)溶液(0.2％醋酸溶液溶解)和岩藻聚糖硫酸酯(Fuc)溶液(蒸馏水溶解)。采用聚电解质自组装方法制备纳米粒子，按照不同的Fuc/Cs体积比(0.6:1，0.8:1，1:1，1.2:1，1.4:1)将壳聚糖溶液滴人岩藻聚糖硫酸酯溶液中，同时使用超声波破碎仪(每开启15s，暂停10s，共40s)混合，得到纳米粒悬浮、液。

1.2.6 Cs-FucNPs的理化性质

采用Br00khaven粒度仪测定纳米粒子的粒径、Zeta电位和多分散系数(PDI)。岩藻聚糖硫酸酯复合率(Fuc复合率)：参考文献的方法，纳米粒子溶液经14000r/min离心15min后取上层清液0.5mL，加入0.5mL蒸馏水，混匀。继续加入0.5mL亚甲基蓝溶液(0.4mmol/L)，混匀，放置5min，于波长560nm处测定吸光度。

Fuc复合率(％)=(Fuc₀-Fuc_上清)/Fuc₀×100(1)

式中，Fuc-纳米粒子溶液中岩藻聚糖硫酸酯的总量，mg；Fuc_上清-离心后上清液中岩藻聚糖硫酸酯的总量，mg。

1.2.7 Cs-FucNPs的体外模拟消化稳定性研究

1.2.7.1 体外消化液配

制模拟过程中使用的人工胃液和人工肠液按照王忠元等的方法配制。

1)模拟胃液的配制

按照《中国药典》2015年版第4部，取稀盐酸16.4mL，添加约800mL水与10g胃蛋白酶，摇匀使其充分溶解后，调节pH值至1.3，加水稀释定容至1000mL，即为人工胃液。

2)模拟肠液的配制

按照《中国药典》2015年版第4部，取磷酸二氢钾6.8g，加500mL水使其溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另外称取10g胰蛋白酶加适量水溶解，将两液混合后，加水定容至1000mL，即为人工肠液。

1.2.7.2 体外模拟消化

化取制备好的纳米乳液15mL于50mL灭菌离心管。加入模拟胃液15mL(37℃预热)，置于恒温振荡器(37℃)中，分别在0，1，2，4，6h取出3mL反应液，在100℃水浴中灭酶，4000r/min离心10min，取离心后溶液2mL测定上清液中纳米微粒的粒径、Zeta电位、PDI等指标。剩余溶液经14000r/min离心15min后，取上清液测定Fuc复合率。上步反应全部结束后，取剩余样液，用0.1mol/L碳酸钠调节pH值至6.8。向管中继续加入肠液15mL(37℃预热)，置于恒温振荡器(37℃)中，分别在0，1，2，4，6h取出3mL，在100℃水浴中灭酶，4000r/min离心10min后取2mL上清液测定其中纳米微粒的粒径、Zeta电位、PDI等指标，剩余溶液经14000r/min离心15min后按上述方法取上清液测定Fuc复合率。

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