液相色谱-串联质谱同时测定食用植物油中的多种真菌毒素（一）

发布时间：2021-10-28 22:22 编辑者：特邀作者周世红

真菌毒素是真菌的次生代谢产物，真菌在一定条件下生长极其迅速，不同菌种产生不同类型的毒素。种类繁多，可导致人和动物急慢性中毒，对人体及动物的健康危害极大。粮食作物在收割过程中因刮伤或储存条件不当，而使真菌毒素迅速累积，造成毒素污染，其污染范围难以控制，危害难以防控。

黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉素等是食用油中经常出现的毒素种类。其中，黄曲霉毒素被世界卫生组织列为“I类致癌物”，其具有亲肝性，可诱发肝炎、肝硬化、甚至肝癌等恶性疾病，危害极大。北京等地区食用油样品的随机抽取结果显示：黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮均有较高的检出率。为保障公众健康，世界各国均对植物油脂中的部分真菌毒素含量制定了相关规定。我国仅对食用植物油中的黄曲霉毒素B1进行了限量(见GB2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》)，规定要求：食用油中黄曲霉毒素B₁含量不得超过10μg/kg，其中花生油和玉米油不得超过20μg/kg。

目前，真菌毒素的检测手段主要有高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法以及液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。其中，酶联免疫法具有简单、快速的优点，多用于单一真菌毒素的快速筛查。其检测结果容易受到基质中的油脂干扰，假阳性高，需要通过其它手段对阳性样品进行确证旧。高效液相色谱法结合荧光检测器或串联质谱仪是目前主要的真菌毒素检测方法，具有稳定性强、灵敏度高的优点，其前处理多数需要分别配合免疫亲和柱/多功能净化柱使用。免疫亲和净化柱是利用抗原抗体的特异性结合达到去除基质中干扰物质的目的，其专一性和选择性较强。然而，键合一种抗体的免疫亲和净化柱只能对单一目标物进行净化，若应用于多毒素筛查则需要对填料进行复配，检测成本昂贵。多功能净化柱可应用于多种毒素的筛查，然而多数多功能净化柱用离子交换填料，会吸附食用油中潜在赭曲霉毒素和伏马毒素等酸性化合物，因此不适合多类真菌毒素的同时筛查。

基于此，本研究通过优化提取方法以及优选多功能净化柱，以实现高效快速的样品前处理，再结合液相色谱-串联质谱法对食用植物油中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素等28种真菌毒素进行风险监测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

甲醇、乙腈(色谱纯级)，美国Sigma公司；甲酸(色谱纯级)，霍尼韦尔贸易(上海)有限公司；甲酸(98％)，国药集团化学试剂有限公司；黄曲霉毒素混合标准溶液、黄曲霉毒素M₁、HT-2毒素、T-2毒素、赭曲霉毒素A、伏马毒素B₁、伏马毒素B₂、伏马毒素B₃、呕吐毒素混合标准溶液[包括：脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、3-葡萄糖苷化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇]，均购自ROMER国际贸易有限公司；渥曼青霉素、赭曲霉毒素B、黄曲霉毒素M₂，均购自北京振翔科技有限公司；新茄病镰刀菌烯醇、蛇形毒素、杂色曲霉素、玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇，均购自上海安谱科技实验股份有限公司。

LC-30AD高效液相色谱仪，日本岛津公司；QTRAP5500三重四级杆质谱仪，美国ABSciex公司；Allegra64R台式高速离心机，美国贝克曼公司：TTL-DCⅡ型氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司；MilliQ超纯水机，美国Millipore公司；CaptivalEMR-Lipid固相萃取净化柱，美国安捷伦公司；QL902涡旋振荡器，德国DragonLab公司：SB-3200DTDN超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 前处理方法

准确称取2.5g食用油样品(精确至0.01g)于15mL离心管中，加入5mL乙腈/水/甲酸提取液(V_乙腈:V_水:V_甲酸=80:18：2)，涡旋振荡1min，超声提取20min，-20℃冷冻10min，5000r/min离心10min，取上层清液全部转移至一洁净试管；向样品试管中加入5mL乙腈/水/甲酸提取液(V_乙睛:V_水:V_甲酸=20:78:2)，同上述步骤进行提取，合并2次提取液并混匀，待净化。

取5mL混合提取液加入CaptivaEMR-Lipid净化柱，加正压使提取液流经净化柱速度为3s/d，待提取液全部流出后，加2mL乙腈/水(V_乙腈:V_水=80:20)溶液冲洗，收集全部净化后的提取液，在50℃水浴下，氮气吹干，加入250μL甲醇/水/甲酸溶液(V甲醇:V_水:V_甲酸=30:70:O.1)复溶，12000r/min离心10min，取上层清液待测。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Shiseido-C18(100mm×2.0mm，3μm)；进样量20μL；流速0.3mL，min；流动相：A相为0.1％甲酸/水溶液，B相为0.1％甲酸/甲醇溶液；正模式洗脱梯度：0～1min30％B，6.5min55％B，8.5min55％B，10min80％B，12min80％B，12.01min30％B，16min30％B；负模式洗脱梯度为：0min3％B，2min55％B，9min70％B，10min99％B，11min99％B，11.1min3％B，15min3％B。