高效液相色谱-三重四极杆复合离子阱质谱法快速检测保健食品中30种缓解疲劳改善睡眠类违禁添加药物（二）

1.3数据处理

数据采集：使用Analyst数据处理软件，将30种化合物离子对信息、液相条件及质谱参数输入软件建立检测方法，经ScheduledMRM→IDA→EPI扫捕模式采集到各化合物的XIC质谱图和EPI质谱图，分别用于定量和定性分析。

谱库建立：创建Analyst与谱库的连接，打开谱库编辑记录，选择各标准物质的EPI质谱图，输入化合物信息，形成30种化合物的EPI据库。

搜库匹配：打开样品数据，点击样品的EPI质谱图，选择自动搜索，获得软件自动搜库比对信息，根据匹配结果判定是否阳性。

2结果与分析

2.1色谱条件的优化

2.1.1流动相的选择

本实验为了兼顾正、负离子同时扫描模式的响应，选用乙腈-乙酸铵溶液作为洗脱溶剂。作为流动相乙腈比甲醇的洗脱能力强，而流动相中加入缓冲溶液可以改善峰型、抑制拖尾，得多种化合物最佳的分离效果和检测灵敏度，实验考察了三种乙酸铵缓冲溶液浓度5mmol/L（a）、10mm01/L（b）、20mm01/L（c）对30种化合物洗脱效果的影响。考察结果发现，采用a溶液为流动相时，色谱峰边缘出现“毛刺”，峰型较差，响应较低；以c溶液为流动相时，色谱峰峰型变宽，影响定最准确性；以b溶液为流动相时，色谱峰峰型较其他两组尖锐，同时响应也最高。因此，实验选用乙腈-10mm01/L乙酸铵溶液作为流动相。

2.1.2色谱柱的选择

由于本方法检测的化合物种类较多，流动相为极性，pH为中性，C₁₈柱是非极性键合相的色谱柱且应用范围广，多化合物分离效果好，因此选用C₁₈柱作为实验用色谱柱。基于30种目标化合物在该类色谱柱中具有不同保留能力，所以可以实现良好的分离。实验考察了三种C18柱，A柱为waLersSunFireC₁₈（100mm×2.1mm，5μm）、B柱为AgilentZORBAXEcliPseXDB-C₁₈（150mm×2.1mm，3.5μm）、C柱为PhenomenexKinetexC₁₈（50mm×2.1mm，2.6μm）的分离效果。实验结果显示：使用A、B柱分离时，30种化合物色谱峰整体出峰数量较少，峰型较宽、分离度较差；C柱与A、B柱相比，色谱峰出峰时间总体缩短，出峰数量最多，峰型较窄，分离度最好。因此本方法选用PhenomenexKinetexC₁₈（50mm×2.1mm，2.6μm）柱作为色潜柱。

2.2质谱条件的优化

2.2.1质谱参数的优化

将稀释好的50ng/mL的混合标准溶液，在多反应监测（MRM）模式下，根据化合物的结构特性，分别采用正离子和负离子扫描：首先，进行全扫描（Scan）模式，根据30种目标化合物的分子量，确定扫描质量范围，逐一确定每种物质的最佳母离子质荷比（Q1）；然后，根据获得的Ql，进行子离子（Q3）的扫捕，选择响应较高干扰较少的两个离子对作为定景和定性离子对，分别优化它们的锥孔电压（DP）和碰撞能量（CE）等质谱参数，使离子对响应强度最大。

2.2.2采集方式的选择

根据MRM采集方式的计算公式：色谱峰宽（本方法为12s）=采集点数×一次扫描时间，由于化合物准确定量要求色谱峰采集点数在15个以上，按照常规MRM采集方式：一次扫描时问=（驻留时间+通道切换时间5ms）×扫描离子对个数，本方法需要扫描60个离子对，计算得到驻留时间为最多为8ms，扫描时问较短，响应值偏低。本方法建立了ScheduledMRM模式下的正、负离同时扫描：在每个化合物的离子对通道中输入相应出峰时间，选择扫描模式（正、负），设置MRM检测窗口时间为40s，扫描时间为0.6s，即在设置的化合物保留时间±20s范围进行离子扫描，检测到的离子对总的扫描时间为0.6s。则本方法采集点数为20个，最多一次需要扫捕16个离子对，因此每个离子对驻留时问最少为32ms，与常规MRM采集方式相比获得的色谱峰峰型更好，响应更强，灵敏度更高，定量准确性更强。ScheduledMRM采集方式使得每对MRM离子的检测只在相应的色谱保留时间内进行，每对MRM都有最恰当的循环时问和驻留时间，确保了定量分析的重现性和数据的可靠性。各化合物特征离子图，见图1。

2.2.3扫描模式的选择

本方法选用ScheduledMRM→TDA→EP扫描模式，在建立好30种化合物的ScheduledMRM模式基础上，设置筛选条件（IDA），包括增强子离子扫描（EPI）扫描速度：1000Da/s，EPI扫捕范同：50～650Da，设置EPI参数，包括碰撞能量（CE）：（35±15）V；去簇电压（DP）：80V。触发SchedulecdMRM→IDA→EPI模式系统根据设置的筛选条件自动判断，经探测扫描，当采集到的化合物信号强度超过预设的值（即出现色谱峰）则系统自动切换（＜1ms）到离子阱模式，进行增强子离子扫描（EPI），获得相应母离子的高质量MS2图谱（含低、中、高三种能量下的复合二级图谱），从而形成该化合物的“指纹”图谱”。如果响应强度未达到预设值则只运行ScheduledMRM采集模式。该模式对目标化合物进行一次扫描，就能获得高灵敏度、高选择性MRM采集信息，用于准确定量；若触发EPI扫捕，还可在线采集EPI图谱，用于确证和结构分析。实现了对目标化合物同时定性定量，从而减少了分析步骤，缩短分析时间。如图2，30种目标化合物的母离子在EPI扫描模式下形成质谱图，该质谱图为叠加三种不同碰撞能量下二级碎片离子质谱图，其响应值为三者的平均值。每种化合物的EPI质谱图都具有特征性且响应较好，用于建立EPI数据库，使样品图谱可进行搜库分析，提高定性准确度。

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