数字PCR技术在食品检测中的应用研究进展（一）

近年来，除食品中转基因成分的安全性、产品标示问题外，食品生产贮藏过程中微生物污染导致的食源性疾病及食品成分掺假等食品安全事件也受到人们越来越多的关注，传统方法难以满足不断提高的快速检测要求，而精准、快速、灵敏、稳定的数字PCR技术则为食品相关检测提供了新的思路和方法。国内外学者研究了数字PCR技术在转基因植物鉴别定量、肉制品中掺假种类及含景分析、食品致病菌检测中的应用，建立高效可行的检测方法并填补了相关检测标准的空白。本文回顾总结了数字PCR技术在食品转基因成分、食品源性成分、微生物检测中的应用，并对其存在的问题进行了分析。

1数字PCR概述

聚合酶链式反应(P01ymnerasechainreaction，PCR)是分子生物学研究中使用较多的方法，主要有普通PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)、反转录PCR(RT—PCR)等。其中qPCR是目前常用的定性及定量基凶分析技术，但该方法需要使用标准品、绘制标准曲线并利用循环阈值对结果进行分析，小仅增大了工作量和检测成本，在实际检测过程也会造成一定误差。

上世纪90年代Sykes等将PCR技术、样品稀释、泊松分布计算方法结合，对白血病克隆的重排免疫球蛋白重链(IgH)基因进行定量，这是数字PCR技术首次出现在大众视野。1999年，VogelsLein等稀释分离单个分子后分别扩增，然后使用荧光探针分析每种产物是否存在突变，检测结肠直肠癌患者粪便中突变的ras基因来证明了其可行性，并首次提出了数字PCR的概念：数字PCR(DigitalPCR，dPCR)是一种针对单分子目标DNA扩增的绝对定量技术。

数字PCR工作原理在于将被标记的样品分割形成大量独立的反应体系，每个独立反应体系中小含或含有一个及以上待测靶标序列，含有待测靶标序列的为阳性，不含待测靶标序列的为阴性。在每个独立反应体系中对被标记的样品进行PCR反应，反应到达终点后，含有待测基因靶标的反应体系中可检测到荧光信号，不含待测基因靶标时没有信号积累，读取阴性、阳性微滴的数量后传至数据处理软件得到最终结果。与qPCR相比，数字PCR无需标准品也不借助循环阈值进行分析，一定程度上弥补了qPCR的不足。

2011年后，数字PCR商业化迅速发展，其中两种类型的数字PCR仪在研究中使用较多，一种是基于高密度微孔芯片的数字PCR(ccPCR)，如LifeTechnologies钴牌的QuanLStudioTM3DDigiLalPCRSystem，每张芯片上含有20000个微孔，满足检测要求。另一种是利用油包水液滴作为载体的数字PCR(DropletdigitalPCR，ddPCR)，如Raindance公司的Raindrop、Bio-Rad公司的QX200^TM及QX100等，其中Bio-Rad公司的QX200TM是现阶段最领先的数字PCR系统。

数字PCR在定量分析过程中无需借助标准物质也无需依赖标准曲线，并且准确度高，灵敏度优于传统方法及qPCR等方法，可达到qPCR方法的10倍甚至更高；在一定检测范同内，线性关系良好，标准偏差小，准确度高，且不同实验室或检测机构问重复实验结果波动小。其作为分子定量检测中最可靠的方法之一，近年来在拷贝数定景、微生物检测、检验检疫、医学诊断研究、基因检测、资源环境科学。等领域均有研究，在食品相关检测方面也有着巨大潜力。

2食品转基因成分分析

目前全球范围内商业化转基因食品中，以能够满足营养要求且能够更好适应栽培条件的转基因植物及以其为原料生产的产品为主，市售转基因产品的种类与数量快速增加，其安全性、标识及市场管理问题等都亟需解决。国内外现行标准中对转基因作物及相关产品的检测主要采用基于外源核酸序列的qPCR技术，为了更加快速准确检测转基因成分，诸多研究者利用数字PCR技术对不同植物转基因成分的检测方法进行研究。

MorisseL等最早建立了利用数字PCR同时检种转基因玉米基因拷贝的绝对数量的方法，得测定的灵敏度及检测范围明显优于cdPCR及qPCR方法，证实了数字PCR在转基因作物检测中的行性及优势。朱鹏宇、缪青梅等研究者分别建立双重ddPCR检测方法对转基因水稻Bt汕优63和抗虫耐除草剂转基凶水稻G6H1进行研究，样品中转成分占总质量0．5％时也可得到精确结果。

Deng等对水稻的不同基因进行了评估和对比，基于SPS、RBE4和ppi-PPF基因建立的ddPCR系统精确可靠，绝对定量检测限(LimitofQuantitation，LOQ)为10～20拷贝／反应，可以重复定量并精确地在LOQ之上对水稻的三个内源基因进行定量，含量低至0.1％时比采用相同探针和引物进行检测的qPCR体系更为准确。于晓帆等用转基因大豆DAS-44406-6的5’端边界序列及lecin流基因，对其定量检测(总DNA模板浓度为50ng／反应时)，相对灵敏度检测方法能对转基冈大豆质量分数为1％的样品准确定量；绝对灵敏度检测限可达到模板DNA质量浓度0．01ng/μL。此外还可利用特殊外源基因及内参基因设计引物建立dPCR方法对油菜、土豆、等转基因作物及油类产品进行研究，最低检测限可达到5个拷贝以下，绝对定量范围均优于qPCR方法。

在对dPCR方法检测限、灵敏度的研究基础上，Wang等将转基因水稻TT51-1制成的米饼采用烘焙、油炸等不同方法处理后进行分析，结果表明，ddPCR方法比qPCR方法更为灵敏，也不易受到加工过程中所产生的PCR抑制剂的影响，对深加工产品中转基因成分的定量更为稳定和准确。Bogozalec等对不同复杂基质饲料中的转基因成分进行检测，得到的结果表明数字PCR技术可以检测浓度较高的样品，而使用qPCR方法则需稀释180倍。当样品中有较高浓度色素、酸性物质、重金属等物质及其他潜在抑制剂时，数字PCR方法的检测结果更准确，避免了可能存在的“假阴性”现象，从而对深加工食品及复杂基质样品进行检测与定量，对于转基因作物研究、市场监督管理及转基因食品标识规范化进程具有重要价值。此外，现有标准中的已有的qPCR检测方法中所采用的引物、探针可转移至数字PCR检测系统中，具有较好的替代性，并且在cdPCR及ddPCR问的一致性及通用性较好。

日前对转基因作物成分进行鉴定时，双重ddPCR及单重ddPCR方法的选择存在一定争议，两种方法的稳定性及检测限均优于qPCR，部分研究表明双重PCR方法的检测限略高于单重PCR，但其标准偏差较小且可以节约实验材料和检测时间，因此需要根据不同检测靶标及引物、探针进行对比选择。有研究者建立了多重数字PCR检测方法，同时检测6、7、11个品系的转基因大豆，能够节约大最成本及时间，为同一物种不同转基因品系的快速检测提供了新的思路。此外，由于转基因动物产品安全性问题争议较大，大部分转基因动物主要用于药物生产或作为生物反应器，仅2015年美国FDA批准上市了转基因三文鱼，国内尚无转基因动物批准上市。有研究者对转人乳铁蛋白基因山羊的数字PCR检测方法进行了研究，证实了其在转基因动物成分外源基因拷贝数检测中的可行性，但在转基因动物为原料的转基因食品中尚无相关报道。对于转基因微生物而言，有研究者利用数字PCR建立基因拷贝数与木聚糖酶活力的关系从而筛选高产木聚糖酶酿酒酵母，并无直接对食品中转基因微生物进行的研究报道。转基因微生物其在食品中的作用主要是生产次级代谢产物如酶制剂、食品添加剂等，近年来有发酵产物中出现未经批准的转基因微生物的食品安全事件发生，已有研究者使用PCR方法及高通量测序方法对发酵产物中的转基因微生物进行检测，因此在未来检测中可考虑使用数字PCR方法对产物中的转基凶微生物进行鉴别及定量，为转基因食品安全性评价提供更多可能。

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