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高效液相色谱-三重四极杆复合离子阱质谱法快速检测保健食品中30种缓解疲劳改善睡眠类违禁添加药物(四)

发布时间:2021-05-21 20:57 编辑者:特邀作者周世红

2.5加标回收试验

取1mg/mL混合标准品溶液50、200uL、1.0mL于10mL容量瓶中,用甲醇分别稀释成5.0、20.0、100.0ug/mL三个浓度梯度的混合标准品溶液。每种基质做低、中、高三个浓度加标:每个梯度取200uL混合标准品溶液分别加入胶囊、片剂和颗粒剂空白基质样品中将片剂、颗粒剂和胶囊(内容物)样品细致研磨,得到均质样品后称量,称取0.1000g左右样品于100mL容量瓶中,加入甲醇适量,超声提取30min,冷却至室温,用甲醇定容至刻度,摇匀,静置,取上清液经0.22μm有机滤膜过滤,取滤液待测。若阳性样品浓度超出线性范围则用甲醇按一定比例稀释后再测。每个梯度检测三组平行样品。色谱柱:PhenomenexKjneLex-C18色谱柱,规格50mm×2.1mm,2.6μm;柱温:40℃;流动相:A为乙腈,B为10mmol/L乙酸铵水溶液;梯度洗脱:0~7min,10%A~90%A,7~8min,90%A,8~8.1min,90%A~10%A,8.1~10min,10%A;流速:250μL/min;进样量:1μL。离子源:TurboV电喷雾离子源(ESI);扫描模式:正、负离子同时扫描,定时多反应监测→信息依赖性获取→增强型子离子扫描(ScheduledMRM→TDA→EP);扫描范围:50~650Da;气帘气(CUR):30psi;碰撞气(CAD):High;喷雾电压(IS):5500V/-4500V;离子源温度:550℃;雾化气(GASl):55psi;辅助气(GAS2):55psi进行加标回收率测定。30种目标化合物加标回收率及相对标准偏差(RSD),结果表明,30种化合物的回收率在84.5%~104.7%之间,RSD均小于5.0%,加标回收试验精密度良好。

2.6精密度和标准品溶液稳定性试验

精确吸取50μL混合标准溶液将30种违禁添加药物分别称取约10mg,置于10mL容量瓶中,11种那非类标准品中加入一定量的乙腈超声溶解后定容,其余标准品加入一定量甲醇超声溶解后定容,均配制成浓度约为1mg/mL的标准品储备液,并保存于-4℃冰箱中。
混合标准品溶液的配制:分别精确吸取30种标准品储备液适黄于一个100mL容量瓶中,用甲醇稀释混匀后定容。使浓度为1~10μg/mL的混合标准品溶液,待使用时进一步稀释。于10mL容最瓶,用甲醇稀释,配制成浓度为5~100ng/mL的混合标液,色谱柱:PhenomenexKjneLex-C18色谱柱,规格50mm×2.1mm,2.6μm;柱温:40℃;流动相:A为乙腈,B为10mmol/L乙酸铵水溶液;梯度洗脱:0~7min,10%A~90%A,7~8min,90%A,8~8.1min,90%A~10%A,8.1~10min,10%A;流速:250μL/min;进样量:1μL。

离子源:TurboV电喷雾离子源(ESI);扫描模式:正、负离子同时扫描,定时多反应监测→信息依赖性获取→增强型子离子扫描(ScheduledMRM→TDA→EP);扫描范围:50~650Da;气帘气(CUR):30psi;碰撞气(CAD):High;喷雾电压(IS):5500V/-4500V;离子源温度:550℃;雾化气(GASl):55psi;辅助气(GAS2):55psi连续进样6次,测定30种化合物定量离子对质潜峰面积的相对标准偏差(RSD)。将浓度为5~100ng/mL的混合标液在避光冷藏0、1、2、4、8、12、24h后分别色谱柱:PhenomenexKjneLex-C18色谱柱,规格50mm×2.1mm,2.6μm;柱温:40℃;流动相:A为乙腈,B为10mmol/L乙酸铵水溶液;梯度洗脱:0~7min,10%A~90%A,7~8min,90%A,8~8.1min,90%A~10%A,8.1~10min,10%A;流速:250μL/min;进样量:1μL。

离子源:TurboV电喷雾离子源(ESI);扫描模式:正、负离子同时扫描,定时多反应监测→信息依赖性获取→增强型子离子扫描(ScheduledMRM→TDA→EP);扫描范围:50~650Da;气帘气(CUR):30psi;碰撞气(CAD):High;喷雾电压(IS):5500V/-4500V;离子源温度:550℃;雾化气(GASl):55psi;辅助气(GAS2):55psi方法检测,以提取的30种日标物定量离子对质谱冈峰而积计算其RSD。结果表明,本方法中30种违禁添加药物的精密度(RSD)为0.8%~5.6%,均小于6%,精密度良好,且混合标准品溶液在24h内稳定。

2.7样品检测

采用本方法对50批次缓解疲劳类和改善睡眠类保健品进行检测,外标法定量。实验结果显示,检出阳性样品共8批次,定量结果见表5。每批次阳性样品至少同时检出两种违禁添加药物,其中检出最多的化合物是硝西泮和炯酸,各检出5批次,其次是西地那非,共检出3批次,氯硝西泮、文法拉辛、硫代艾地那非各检出2批次,氯苯那敏检出1批次。所有阳性样品EPI谱图均经过EPI数据库(2.3)比对确证,以Fit、RevFit和Purity三个参数表示检索结果,其数值体现与目标化合物的匹配程度。其中FiL(F)代表正符合率,即标准品谱峰与样品谱峰的相似度,最大值为100,值越大说明是该化合物的可能性越大;RevFit(R)代表反符合率,即样品谱图与标准品谱图的相似度;Purity(P)代表纯度,是综合前两种结果得出的数值,即样品谱图与数据库中的标准品谱图之问在质量数、丰度等参数方面的相似度。EPI数据库搜库结果中目标化合物按照P值从大到小的顺序排列;部分阳性样品质谱对比图见图3。

3结论

本实验采用高效液相色谱-三重四极杆复合离子阱质谱(HPLC-QTRAP-MS)对缓解疲劳类和改善睡眠类保健品中30种违禁添加药物建立了快速检测方法。在8min以内完成了对30种化合物的检测。该方法选用乙腈-10mmoL/L乙酸铵溶液作为流动相,PhenomenexKinetexC18(50mm×2.1mm,2.6μm)柱为色谱柱进行分离;选用定时多反应监测(SchedulenedMRM)模式下的正、负离切换方式进行定量检测分析;选用定时多反应临测(ScheduledMRM)-信息依赖性采集(IDA)-增强子离子扫捕(EPI)扫描模式,在定量分析的同时获得3个能力级别的二级碎片离子质谱图复合而成的增强型二级碎片离子(EPI)质谱图,建立30种化合物的EPI数据库,进行定性确证。

本方法采用正负离子同时扫描模式,可以同时检测30种违禁添加药物,加快了检测速度;选择ScheduledMRM采集方式,获得最佳色谱峰进行定量分析,提高了检测灵敏度和定量准确性;建立了EPI数据库用于阳性确证和结构分析,确保了定性准确性;优化了搜库比对步骤,设置系统自动切换离子阱模式,在线采集EPI图谱,计算比对结果,缩短分析时问,加快定性速度。本方法实现了一针进样同时对30种违禁添加药物进行定量、定性和确证,具有通量大、速度快、操作简便、灵敏度高、准确性强能的特点,为新形势下的保健食品监管提供有效的技术支持。

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