农药残留的酶活性抑制与免疫分析技术的免疫分析法（十）

(5)杂交瘤细胞培养与抗体的分离取筛选出的阳性杂交瘤细胞在CO₂培养箱中进行体外培养，从培养液中分离单克隆抗体。或选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用4-甲基十五烷或液体石蜡进行腹腔注射，1周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中。接种1周后收集小鼠的腹水，分离腹水中的单克隆抗体。

3、抗体纯化单克隆抗体的纯化方法与多克隆抗体的纯化方法类似。目前最有效的单克隆抗体的纯化方法是免疫亲和色谱法，该法将葡萄球菌A蛋白或抗小鼠免疫球蛋白与适当载体(最常用的是Sepharose)交联，制备免疫亲和色谱柱，将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。

(四)标记物的制备与纯化

半抗原、抗原和抗体的标记根据所选的标记免疫分析方法不同，选用不同的标记物。如酶联免疫吸附测定法(ELISA)常用的标记物有辣根过氧化物酶(horseradish Deroxidase，HRP)、碱性磷酸酯酶(alkaline phosptlatase，AP)等，流动注射免疫分析(FIIA)常用的标记有鲁米诺等，(ABS)系统所用的标记物为生物素，金标免疫分析所用的标记物是纳米金。

1、半抗原的标记与纯化

半抗原的标记依标记物的种类和半抗原的活性基团不同采用不同标记方法。如用辣根过氧化物酶标记含游离羧基的半抗原，通常采用碳二亚胺法、活性酯法或混合酸酐法。用辣根过氧化物酶标记含有游离氨基的半抗原可采用戊二醛法、二异硫氰酸酯法等。需要注意的是，辣根过氧化物酶催化过氧化物释放活性氧，一些化学性质不够稳定、容易被氧化的半抗原(如酚类化合物等)在与辣根过氧化物酶共价耦联的过程中要注意避光避氧，防止半抗原被氧化后导致相应抗体无法识别。

酶标半抗原的纯化可采用透析、超滤离心法。小分子标记物标记的半抗原可采用薄层色谱、柱色谱法分离纯化。

2、抗原的标记与纯化

抗原的标记视抗原的种类和特性而定。在农药免疫分析中，所用的抗原是人工合成的(半抗原与载体蛋白的耦联物)，因此标记物可以标记在人工抗原的载体蛋白上。蛋白质类抗原的标记、纯化，与抗体的标记、纯化方法类似。

3、抗体的标记与纯化

抗体的标记根据标记物的不同采用不同的标记方法。辣根过氧化物酶标记抗体常采用改良的过碘酸盐法，即将辣根过氧化物酶分子中糖的醇羟基氧化成醛基后与抗体的游离氨基共价耦联。分子中含游离羧基(如生物素等)、游离氨基的标记物(如辣根过氧化物酶)与抗体的耦联方法类似于含游离羧基、氨基的半抗原与载体蛋白的共价耦联。含芳香族伯胺的标记物，采用重氮化法与抗体分子中酪氨酸残基的酚羟基邻位形成偶氮键连接。含异氰酸酯结构的标记物可与抗体的游离氨基直接耦联。为防止标记物耦联在抗体的抗原结合部位而导致抗体的免疫学活性降低，可采用马来酰亚胺类活性酯等方法将标记物与单链抗体的巯基共价连接，因为抗体的抗原结合部位不含巯基。纳米金标记抗体则采用物理吸附法。

由于标记物的分子大小不同，标记抗体的纯化方法也不同。如标记物为小分子化合物，标记抗体的纯化可采用透析、离心超滤法。若标记物为大分子(如辣根过氧化物酶)，标记抗体的纯化通常采用Sephadex凝胶柱色谱法。如用小分子标记物标记半抗原，可采用薄层色谱、硅胶柱色谱法分离纯化。

(五)免疫分析技术的建立与条件优化

1、抗原和抗体的浓度选择

抗原抗体反应中，抗体的浓度需与抗原浓度相适应，通常采用方阵实验法筛选抗原抗体的最适浓度组合。

(1)间接竞争酶联免疫吸附测定法中包被原和抗体浓度的选择，对于问接竞争酶联免疫吸附测定法，包被原和抗体浓度的选择步骤如下。

①包被：将包被原用pH 9.6的碳酸盐缓冲液倍比稀释成一定的浓度系列，100μL/孔，包被酶标板不同的行，空白对照孔加等体积缓冲液，4℃下吸附过夜。

②封闭：次日倾去包被液，洗涤去除游离物，加封闭液150μL/孔，37℃下封闭1.5 h。洗涤去除游离物。

③反应：将抗体用适当pH的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer，PB)倍比稀释至一定浓度系列加入酶标板的不同列，100μL/孔，37℃下反应1～1.5 h。洗涤去除游离物。

④加酶标二抗：将酶标二抗稀释至工作浓度，加至酶标板，100μL/TL，37℃下反应1～1.5 h。洗涤去除游离物。

⑤显色测定：加底物与显色剂混合液100μL/孔，37℃下避光反应15 min。加50μL/孔终止剂终止反应，在酶标仪上测定各孔的吸光值。

分别以包被原浓度和抗体浓度为横坐标、以吸光值为纵坐标作图。选择吸光值约为1.0抗原和抗体浓度都较低、处于吸光曲线拐点处的抗原和抗体浓度为最适浓度组合。

(2)包被抗原直接竞争酶联免疫吸附测定法中包被原和酶标抗体浓度的选择在包被抗原直接竞争酶联免疫吸附测定法中，包被原和酶标抗体浓度的选择步骤如下。

①包被：将包被原用pH 9.6的碳酸盐缓冲液倍比稀释成一定的浓度系列，包被酶标板的不同行，100μL/TL，空白对照孔加等体积缓冲液，4℃下吸附过夜。

⑦封闭：次日倾去包被液，洗涤去除游离物，加封闭液150μL/TL，37℃下封闭1.5 h。洗涤去除游离物。

③反应：将酶标抗体倍比稀释成工作浓度系列，加至酶标板的不同列，100μL/孔，37℃下反应1～1.5h。洗涤去除游离物。

④显色测定：加底物与显色剂混合液100μL/孔，37℃下避光反应15min，加终止剂50μL/孔终止反应，在酶标仪上测定各孔的吸光值。

分别以包被原浓度和酶标抗体浓度为横坐标、以吸光值为纵坐标作图。选择吸光值约为1.0处于吸光曲线拐点处的包被原和酶标抗体浓度为最适浓度组合。

(3)包被抗体直接竞争酶联免疫吸附测定法中抗体和酶标半抗原浓度的选择在包被抗体直接竞争酶联免疫吸附测定法中，抗体和酶标半抗原浓度的选择步骤如下。

①包被：将抗体用适当pH的磷酸盐缓冲液倍比稀释成一定的浓度系列并包被酶标板的不同行，100μL/TL，空白对照孔加等体积磷酸盐缓冲液，4℃下吸附过夜。

②封闭：次日倾去包被液，洗涤去除游离物，加封闭液150 μL/TL，37℃下封闭1.5 h。洗涤去除游离物。

③反应：将酶标半抗原用磷酸盐缓冲液倍比稀释成一定浓度系列并加至酶标板的不同列，100μL/TL，37℃下反应1～1.5 h。洗涤去除游离物。

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